血T紧张素转化酶活性检测试剂盒 微量法

血管紧张素转化酶（ACE）活性检测试剂盒说明书

微量法

货号：BC5545

规格：100T/96S

产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

产品说明：

血管紧张素转化酶（Angiotensin Converting Enzyme，ACE，EC 3.4.15.1，也称为ACE1）是一种含锌二肽羧基肽酶，相对分子质量为120-150kDa，主要存在于肺、脑、肾等各种组织内皮细胞，上皮细胞、血浆和尿液中也有存在，正常情况下肺组织含量最高。ACE主要功能是催化血管紧张素Ⅰ转化为血管紧张素Ⅱ，后者可引发血管强烈收缩，促进肾上腺皮质激素醛固酮的合成和释放。ACE活性检测对于肺部、肝脏、甲状腺等器官疾病的诊断和治疗具有重要意义。

ACE可催化底物N-[3-（2-呋喃基）丙烯酰基]- L -苯丙氨酰-甘氨酰-甘*酸（FAPGG）水解生成呋喃丙烯酰基- L -苯丙*（FAP）和双甘氨肽（GG）。FAPGG在340nm处有特征吸收峰，根据其在340nm的变化速率，可计算得到ACE活性大小。

FAPGG（340nm）                               FAP + GG

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

紫外分光光度计/酶标仪、低温离心机、分析天平、研钵/匀浆器/细胞超声破碎仪、水浴锅/恒温培养箱、微量石英比色皿/96孔UV板、可调式移液枪、冰和蒸馏水。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1. 组织：按照组织质量（g）：试剂一体积（mL）为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL试剂一）进行冰浴匀浆。12000g，4℃离心20min，取上清置于冰上待测。

2. 细胞：按照细胞数量（10⁴个）：试剂一体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL试剂一），冰浴超声波破碎（功率200W，超声3秒，间隔7秒，总时间5min）。12000g，4℃离心20min，取上清置于冰上待测。

3. 血浆/血清：直接测定。若有浑浊请离心后取上清置于冰上待测。

二、测定步骤

1、 紫外分光光度计/酶标仪预热30min以上，调节波长至340nm，紫外分光光度计蒸馏水调零。

2、 试剂一于37℃预热10min以上。

3、 在微量石英比色皿/96孔UV板中按下表步骤加样：

三、血管紧张素转化酶（ACE）活性计算

1. 使用微量石英比色皿测定：

（1） 按样本蛋白浓度计算

单位的定义：37℃下每mg组织蛋白在反应体系中每分钟催化1nmol FAPGG水解定义为一个酶活力单位。

ACE活性（U/mg prot）=ΔA÷（ε×d）×V反总×10⁹÷（Cpr×V样本）÷T×F=527.7×ΔA÷Cpr×F

（2） 按样本质量计算

单位的定义：37℃下每g组织在反应体系中每分钟催化1nmol FAPGG水解定义为一个酶活力单位。

ACE活性（U/g 质量）=ΔA÷（ε×d）×V反总×10⁹÷（W×V样本÷V提取）÷T×F=527.7×ΔA÷W×F

（3） 按细胞计算

单位的定义：37℃下每10⁴个细胞在反应体系中每分钟催化1nmol FAPGG水解定义为一个酶活力单位。

ACE活性（U/10⁴ cell）=ΔA÷（ε×d）×V反总×10⁹÷（N×V样本÷V提取）÷T×F=527.7×ΔA÷N×F

（4）按照血清（浆）体积计算

单位的定义：37℃下每mL血清（浆）在反应体系中每分钟催化1nmol FAPGG水解定义为一个酶活力单位。

ACE活性（U/mL）=ΔA÷（ε×d）×V反总×10⁹÷V样本÷T×F=527.7×ΔA×F

ε：FAPGG在340nm处的摩尔消光系数，758L/(mol·cm)；d：比色皿光径，1cm；V反总：反应体系总体积，2×10^-4L； 10⁹：单位换算系数，1mol=10⁹nmol；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；V样本：反应体系中加入的样本体积，0.1mL；V提取：加入试剂一的体积，1mL；T：反应时间，5min；W：样本质量，g；N：细胞总数，以10⁴计；F：稀释倍数。

2. 使用96孔UV板测定：

将上述公式中的d=1cm改为d=0.6cm（96孔UV板光径）进行计算即可。

注意事项：

1. 为保证实验结果的准确性和稳定性，请严格控制反应时间和操作时间。

2. 样本吸光度初始值A1测定大于1.6（微量石英比色皿）/1（96孔UV板）或ΔA测定大于0.4（微量石英比色皿）/0.3（96孔UV板）时，建议将样本用试剂一稀释后再进行测定。当ΔA测定小于0.01时，可以延长反应时间来测定。计算时注意同步更改计算公式。

实验实例：

1. 取0.1027g小鼠肺脏样本，加入1mL试剂一进行冰浴匀浆，离心后取上清，稀释4倍后按照测定步骤操作，用微量石英比色皿测得计算：ΔA空白=A1空白-A2空白=1.0037-1.0021=0.0016，ΔA测定=A1测定-A2测定= 1.4637-1.1426=0.3211，ΔA=ΔA测定-ΔA空白=0.3211-0.0016=0.3195，按样本质量计算酶活得：

ACE活性（U/g 质量）=527.7×ΔA÷W×F =6566.705 U/g 质量。

2. 取牛血清样本，稀释2倍后按照测定步骤操作，用微量石英比色皿测得计算：ΔA空白=A1空白-A2空白=1.0037- 1.0021=0.0016，ΔA测定=A1测定-A2测定=1.2163-1.1277=0.0886，ΔA=ΔA测定-ΔA空白=0.0886-0.0016=0.087，按血清（浆）体积计算酶活得：

ACE活性（U/mL）= 527.7×ΔA×F=91.820 U/mL。

参考文献：

[1] Murray B A, Walsh D J, Fitzgerald R J. Modification of the furanacryloyl-L-phenylalanylglycylglycine assay for determination of angiotensin-I-converting enzyme inhibitory activity[J]. Journal of Biochemical & Biophysical Methods, 2004, 59(2): 127-137.

[2] Gajanan P G, Elavarasan K, Shamasundar B A. Bioactive and functional properties of protein hydrolysates from fish frame processing waste using plant proteases[J]. Environmental Science & Pollution Research, 2016, 23(24): 24901-24911.

[3] Sun S, Xu X, Sun X, et al. Preparation and Identification of ACE Inhibitory Peptides from the Marine Macroalga Ulva intestinalis[J]. Marine Drugs, 2019, 17(3).

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