羟甲基戊二酰辅*A 合成酶活性盒 脂肪酸

羟甲基戊二酰辅*A合成酶（HMGCS）活性检测试剂盒说明书

可见分光光度法

货号：BC5430

规格：50T/48S

产品内容：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

溶液的配制：

1、 试剂一：临用前加入1mL蒸馏水充分溶解。-20℃分装以保存4周，避免反复冻融。

2、 试剂一工作液的配制：按照试剂一：蒸馏水=50μL：1150μL（1.2mL，约9T）的比例配制，根据样本量现配现用，当天用完。

3、 试剂二：临用前加入1mL蒸馏水充分溶解。-20℃分装以保存4周，避免反复冻融。

4、 试剂二工作液的配制：按照试剂二：蒸馏水=100μL：1100μL（1.2mL，约9T）的比例配制，根据样本量现配现用，当天用完。

产品说明：

甲羟戊酸途径 是一个非常重要的代谢途径，参与许多重要萜类的前体物的合成，是萜类生物合成的重要途径。羟甲基戊二酰辅*A合成酶催化乙酰CoA和乙酰乙酰CoA，生成羟甲基戊二酰辅*A，是胆*醇和类异 戊二烯生物合成中的关键步骤。

HMGCS催化乙酰CoA与乙酰乙酰CoA生成羟甲基戊二酰CoA，同时产生CoASH，使DTNB转化为黄色的TNB，在412nm下有特征吸光值。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计、分析天平、水浴锅/恒温培养箱、台式离心机、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵/匀浆器/细胞超声破碎仪、蒸馏水和冰。

操作步骤：

一、 样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1. 组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），

进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

2. 细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（10⁶个）：提取液体积（mL）为5~10：1的比例（建议5百万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

二、 测定步骤

1. 可见分光光度计预热30min以上，调节波长至412nm，蒸馏水调零。

2. 根据样本量取部分试剂一工作液、试剂二工作液、试剂三于37℃预热10min。

3. 操作表：（在微量玻璃比色皿中加入下列试剂）

将上述试剂加入微量玻璃比色皿中充分混匀，于412nm处测定10s时的吸光值A1，迅速置于37℃水浴锅或者恒温培养箱中反应20min，拿出迅速擦干测定20min10s时的吸光值A2，记录412nm下10s时吸光值A1和20min后的吸光值A2。计算ΔA测定=A2测定-A1测定，ΔA空白=A2空白-A1空白，ΔA=ΔA测定-ΔA空白。空白管只需做1-2次。

三、HMGCS活性计算

1. 按蛋白浓度计算

酶活定义：每mg组织蛋白每分钟催化产生1nmol TNB为一个酶活力单位。

HMGCS活性（U/mg prot）=ΔA÷（ε×d）×10⁹×V反总÷（V样×Cpr）÷T=7.353×ΔA÷Cpr

2. 按样本质量计算

酶活定义：每g组织每分钟催化产生1nmol TNB为一个酶活力单位。

HMGCS活性（U/g 质量）＝ΔA×V反总÷（ε×d）×10⁹÷（W ×V 样÷V 样总）÷T=7.353×ΔA÷W

3. 按细胞/细菌数量计算

酶活定义：每10⁶个细菌或细胞每分钟催化产生1nmol TNB为一个酶活力单位。

HMGCS活性（U/10⁶ cell）＝ΔA×V反总÷（ε×d）×10⁹÷（N×V样÷V样总）÷T=7.353×ΔA÷N

V反总：反应体系总体积，1×10^-3L；ε：TNB摩尔消光系数，1.36×10⁴L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.5mL；V样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，20min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；N：细胞或细菌总数，以10⁶计。

注意事项：

1. 如果ΔA吸光值过低或接近空白，适当延长反应时间或加大样本量后，重新测定。注意同步修改计算公式。

2. 如果A2＞1或者ΔA＞0.8，建议将样本适当稀释后或者缩短反应时间进行测定。注意同步修改计算公式。

实验实例：

1、 称取0.1046g平菇，加入提取液进行冰浴匀浆，提取液将上清稀释2倍，按照测定步骤操作，用1mL玻璃比色皿测得计算∆A测定=A2测定-A1测定=0.901-0.565=0.336，∆A空白=A2空白-A1空白=0.150-0.103=0.047，∆A=∆A测定-∆A空白=0.289，按样本质量计算酶活得：

HMGCS活性（U/g 质量）＝7.353×ΔA÷W×2=40.63 U/g 质量

2、 称取0.1070g青椒，加入提取液进行冰浴匀浆，按照测定步骤操作，用1mL玻璃比色皿测得计算∆A测定=A2测定-A1测定=0.476-0.340=0.136，∆A空白=A2空白-A1空白=0.150-0.103=0.047，∆A=∆A测定-∆A空白=0.089，按样本质量计算酶活得：

HMGCS活性（U/g 质量）＝7.353×ΔA÷W=6.12 U/g 质量

参考文献：

[1] Skaff D A, Miziorko H M. A visible wavelength spectrophotometric assay suitable for high-throughput screening of 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA synthase[J]. Analytical Biochemistry, 2010, 396(1):96-102

[2] Scharnagl H, W März, Schliack M, et al. A novel assay for cytosolic 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A synthase activity using reversed-phase ion-pair chromatography: demonstration that Lifibrol (K12.148) modulates the enzyme activity[J]. Journal of Lipid Research, 1995, 36(3):622-627.

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