线粒体乙醛脱氢酶活性检测试剂盒 脂肪酸

线粒体乙醛脱氢酶（ALDH2）活性检测试剂盒说明书

紫外分光光度法

货号：BC5510

规格：50T/48S

产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

溶液的配制：

1、 试剂二：临用前取一瓶试剂二加入3mL蒸馏水溶解，用不完的试剂-20℃分装保存4周，避免反复冻融；

2、 试剂五：沸点低，在使用时保持低温以保证正确的吸取量。用后及时封口。

3、 工作液：临用前根据样本数量按照试剂一：试剂二：试剂三：试剂四：试剂五=550µL：100µL：20µL：30µL：100µL（800µL，1T）的比例配制工作液，现用现配。

产品说明：

线粒体乙醛脱氢酶（aldehyde dehydrogenase 2，ALDH2）属于乙醛脱氢酶蛋白家族，存在于很多组织，特别是肝脏组织内含量较高。该酶主要参与乙醇代谢过程的第二步，在线粒体内将乙醛氧化成羧酸，然后进入三羧酸循环，被分解，解除乙醛对生物体的毒害作用。另外，ALDH2也可作为酯酶参与硝*油的代谢途径，是硝*油重要的生物活性剂。

ALDH2催化乙醛和NAD⁺转化为乙酸和NADH，利用NADH在340nm处吸光值的变化即可计算得到ALDH2的活性。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

紫外分光光度计、台式离心机、分析天平、水浴锅/恒温培养箱、1mL石英比色皿、可调式移液枪、研钵/匀浆器/细胞超声破碎仪、冰和蒸馏水。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1. 称取约0.1g组织或收集500万细胞，加入1mL提取液，在冰上用匀浆器或研钵进行快速匀浆（匀浆器可上下研磨30次左右）。

2. 4℃ 600 g离心10min（如需获得纯度更高的线粒体，可将此步离心速度改为1000g）。

3. 将上清液移至另一离心管中，4℃ 11000 g离心15min，弃上清，留沉淀。

4. 在沉淀中加入400μL提取液，超声波破碎（功率200W，超声5秒，间隔10秒，重复15次），用于ALDH2活性测定，若用蛋白浓度计算，取20μL用于蛋白含量测定。

二、测定步骤

1、 紫外分光光度计预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。

2、 工作液37℃预热20min。

3、 操作表：

三、ALDH2酶活计算

1. 按蛋白浓度计算

酶活定义：每毫克蛋白每分钟生成1nmol的NADH定义为1个酶活单位。

ALDH2活性（U/mg prot）=ΔA÷（ε×d）×10⁹×V反总÷（V样×Cpr）÷T×F=26.795×ΔA÷Cpr×F

2. 按样本质量计算

酶活定义：每克样本每分钟生成1nmol的NADH定义为1个酶活单位。

ALDH2活性（U/g 质量）=ΔA÷（ε×d）×10⁹×V反总÷（V样×W÷V样总）÷T×F =10.718×ΔA÷W×F

3. 按细胞数量计算

酶活定义：每10⁶个细胞每分钟生成1nmol的NADH定义为1个酶活单位。

ALDH2活性（U/10⁶ cell）=ΔA÷（ε×d）×10⁹×V反总÷（V样÷V样总×N）÷T×F =10.718×ΔA÷N×F

ε：NADH摩尔消光系数，6.22×10³ L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V反总：反应体系总体积，1×10^-3L；V样：反应体系中加入样本上清体积，0.2mL；V样总：线粒体沉淀中加入提取液体积，0.4mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL，需自行测定；W：样本质量，g；N：细胞总数，以10⁶计；T：反应时间，30min；10⁹：单位换算系数，1mol=10⁹nmol；F：稀释倍数。

注意事项：

1、 试剂四有毒性，实验过程中，请佩戴好防护用具。

2、 由于提取液中含有一定浓度的蛋白（约1mg/mL），所以在测定样本蛋白浓度时需要减去提取液本身的蛋白含量（单独测量）。

3、 样本ΔA大于1时，建议将样本用提取液稀释后再进行测定。当ΔA小于0.01时，可以延长反应时间（60min或更长）来测定。计算时注意同步更改计算公式。

实验实例

1、 取0.1067g小鼠肝脏进行样本处理，用提取液稀释4倍后，按照测定步骤操作，用1mL石英比色皿测得计算ΔA测定=A2测定-A1测定=1.271-0.282=0.989，ΔA空白=A2空白-A1空白=0.115-0.115=0，ΔA=ΔA测定-ΔA空白=0.989-0=0.989，按样本质量计算酶活得：

ALDH2活性（U/g质量）=10.718×0.989÷0.1067×4=397.380 U/g质量。

2、 取0.1069g冬枣果肉进行处理，按照测定步骤操作，用1mL石英比色皿测得计算ΔA测定=A2测定-A1测定=0.267-0.162=0.105，ΔA空白=A2空白-A1空白=0.115-0.115=0，ΔA=ΔA测定-ΔA空白=0.105-0=0.105，按样本质量计算酶活得：

ALDH2活性（U/g质量）=10.718×0.105÷0.1069=10.528 U/g质量。

3、 取8×10⁶个细胞进行样本处理，按照测定步骤操作，用1mL石英比色皿测得计算ΔA测定=A2测定-A1测定=0.249-0.154=0.095，ΔA空白=A2空白-A1空白=0.115-0.115=0，ΔA=ΔA测定-ΔA空白=0.095-0=0.095，按细胞数量计算酶活得：

ALDH2活性（U/10⁶ cell）=10.718×0.095÷8=0.127 U/10⁶ cell。

参考文献：

[1] Feng Liu, Xiangqin Cui, Harry Horner, et al. Mitochondrial aldehyde dehydrogenase activity is required for male fertility in maize. The Plant Cell. May 2001, 13:1063-1078

[2] Ying Hu, Jinbin Yin, Mingzhi Zheng, et al. Mitochondrial aldehyde dehydrogenase activity protects against lipopolysaccharideinduced cardiac dysfunction in rats. Molecular Medicine Reports. February 2015, 11:1509-1515

[3] Amit Joshi, Lauren Wassenhove, Kelsey Logas, et al. Aldehyde dehydrogenase 2 activity and aldehydic load contribute to neuroinflammation and Alzheimer’s disease related pathology. Acta Neuropathologica Communications. December 2019, 7:190

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