碳酸酐酶活性检测试剂盒 其它

碳酸酐酶活性检测试剂盒说明书

可见分光光度法

货号：BC5440

规格：50T/48S

产品内容：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

溶液的配制：

1、 试剂二：试剂放于试剂瓶内玻璃瓶中。临用前取一支试剂二，加入320μL丙酮充分震荡溶解，-20℃可以分装保存1周，避免反复冻融。

2、 试剂二工作液：临用前按试剂二：蒸馏水=40μL：960μL（5T）的比例进行混合配制成试剂二工作液，现用现配，用多少配多少。 

3、 标准品：5μmol/mL 酚标准液。临用前取100μL的5μmol/mL 酚标准液于EP管中，加入1500μL蒸馏水充分混合，配制成0.3125 μmol/mL的酚标准液。

产品说明：

碳酸酐酶（Carbonic Anhydrase，CA，EC4.2.1.1）是一种以 Zn²⁺为活性中心的金属酶，可用来高效催化 CO₂ 的可逆水合反应：CO₂+H₂O⇋HCO₃^-+H⁺，催化速率可达自然条件下的10⁷倍，是目前已知催化速率最快的酶之一。

碳酸酐酶可催化乙酸对硝基苯酯反应生成对硝基*酚，通过检测405nm处吸光值上升速率反映碳酸酐酶活性。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计、水浴锅/恒温培养箱、分析天平、台式离心机、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵/匀浆器/细胞超声破碎仪、蒸馏水和冰。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1、组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

2、细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（10⁴个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率200W，超声3s，间隔10s，重复30次），8000g，4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

3、液体：直接测定。(若溶液呈现浑浊，则离心取上清后再测定)。

二、测定步骤

1、 可见分光光度计预热30min以上，调节波长至405nm，蒸馏水调零。

2、 标准管测定：

（1） 标准管的测定：在比色皿中加入100μL标准液，900μL试剂一，充分混匀后于405nm处测定吸光值，记作A_标准。

（2） 标准空白管的测定：在比色皿中加入100μL蒸馏水，900μL试剂一，充分混匀后于405nm处测定吸光值，记作A_标准空白。

（3） 计算∆A_标准=A_标准-A_标准空白。（标准管和标准空白管只需做1-2次。）

3、 操作表：（在1mL玻璃比色皿中加入）

按照加样表依次在1mL玻璃比色皿加入上述试剂，立即充分混匀后于405nm处测定10s时的吸光值A1，迅速置于37℃水浴锅或者恒温培养箱中反应5min，拿出迅速擦干测定5min10s时的吸光值A2。计算A_测定=A2_测定-A1_测定，A_空白=A2_空白-A1_空白，∆A =A_测定-A_空白。（空白管只需做1-2次。）

三、CA活性计算

(1) 按样本蛋白浓度计算

单位的定义：37℃，每mg组织蛋白每分钟催化产生1μmol 对硝基*定义为一个酶活力单位。

CA活性（U/mg prot）=C_标×∆A÷∆A_标准×V_样÷（V_样×Cpr）÷T×F=0.0625×∆A÷∆A_标准÷Cpr ×F

(2) 按样本质量计算

单位的定义：37℃，每g组织每分钟催化产生1μmol 对硝基*酚定义为一个酶活力单位。

CA活性（U/g 质量）=C_标×∆A÷∆A_标准×V_样÷（V_样÷V_样总×W）÷T×F=0.0625×∆A÷∆A_标准÷W×F

(3) 按液体体积计算

单位的定义：每mL液体每分钟催化产生1μmol 对硝基*酚定义为一个酶活力单位。

CA活性（U/mL）=C_标×∆A÷∆A_标准× V_样÷V_样÷T×F=0.0625×∆A÷∆A_标准×F

C_标：标准品浓度，0.3125μmol/mL；V_样：反应体系中加入的样本体积，0.1mL；V_样总：加入的提取液体积，1mL；T：反应时间，5min；Cpr：蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g； F：样本稀释倍数。

注意事项：

如果A1测定大于0.5或者∆A大于1，可以用蒸馏水对样本进行稀释或者缩短37℃酶促反应时间；∆A小于0.02，可以加大样本量或者延长37℃酶促反应时间。注意计算时同步修改计算公式。

实验实例：

1、 称取0.1029g小鼠肝脏组织，加入提取液进行冰浴匀浆，离心后取上清，将上清稀释160倍后，按照测定步骤操作，用1mL玻璃比色皿测得计算A_测定=A2_测定-A1_测定=0.599-0.169=0.43，A_空白=A2_空白-A1_空白=0.266-0.13=0.136，∆A =A_测定-A_空白=0.294，∆A_标准=A_标准-A_标准空白=0.434-0.003=0.431，带入公式计算：

CA活性（U/g 质量）=0.0625×∆A÷∆A_标准÷W×F=66.29 U/g 质量

2、 称取0.1058g娃娃菜叶片组织，加入提取液进行冰浴匀浆，离心后取上清，将上清稀释4倍后，按照测定步骤操作，用1mL玻璃比色皿测得计算A_测定=A2_测定-A1_测定=0.424-0.158=0.266，A_空白=A2_空白-A1_空白=0.266-0.13=0.136，∆A =A_测定-A_空白=0.13，∆A_标准=A_标准-A_标准空白=0.434-0.003=0.431，带入公式计算：

CA活性（U/g 质量）=0.0625×∆A÷∆A_标准÷W×F=0.713 U/g 质量

3、 吸取100μL兔血清，将血清用蒸馏水稀释8倍后，按照测定步骤操作，用1mL玻璃比色皿测得计算A_测定=A2_测定-A1_测定=0.739-0.197=0.542，A_空白=A2_空白-A1_空白=0.266-0.13=0.136，∆A =A_测定-A_空白=0.406，∆A_标准=A_标准-A_标准空白=0.434-0.003=0.431，带入公式计算： 

CA活性（U/mL）=0.0625×∆A÷∆A_标准×F=0.471 U/mL

参考文献：

[1] BROWNELL, P. F, BIELIG, et al. Increased Carbonic Anhydrase Activity in Leaves of Sodium-Deficient C4 Plants[J]. Functional Plant Biology, 1991, 18(6):589-592.

[2] A, V. Tavallali , et al. Zinc influence and salt stress on photosynthesis, water relations, and carbonic anhydrase activity in pistachio. Scientia Horticulturae, 2009, 123(2): 272-279.

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