抗氟离子酸性磷酸酶活性检测试剂盒 微量法

抗氟离子酸性磷酸酶（FRAP）活性检测试剂盒说明书

微量法

货号：BC5455

规格：100T/48S

产品内容：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

溶液的配制：

1、 试剂三：临用前加入1mL蒸馏水，充分溶解，未用完的试剂-20℃保存可以保存4周，避免反复冻融。一支试剂溶解后可以做100T，为了延长试剂盒使用时间，因此多给一支粉剂。

2、 试剂四：临用前加入5.5mL蒸馏水，充分溶解，未用完的试剂2-8℃保存可以保存4周。

3、 试剂五：临用前根据样本量按照试剂五：蒸馏水=1:9的比例配制，现用现配。

4、 标准品：5μmol/mL 酚标准液。临用前取100μL的5μmol/mL 酚标准液于EP管中，加入300μL蒸馏水充分溶解，配制成1.25 μmol/mL的酚标准液。

产品说明：

抗氟离子酸性磷酸酶(fluoride resistant acid phosphatase, FRAP)是酸性磷酸酶的一种。抗氟离子酸性磷酸酶主要分布于在绝大多数细胞的溶酶体中、前列腺(prostate gland)、脑、肝脏、脾脏和血小板。

抗氟离子酸性磷酸酶的活性不被氟离子抑制，而其他的酸性磷酸酶的活性则会受到氟离子的抑制。酸性条件下，抗氟离子酸性磷酸酶催化PN PP生成对硝 基苯*。对硝 基苯*在碱性条件下呈黄色，可以在400nm波长下检测吸光度。产物黄色越深，说明抗氟离子酸性磷酸酶活性越高，反之则酶活性越低。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计/酶标仪、低温离心机、分析天平、水浴锅/恒温培养箱、可调式移液器、微量玻璃比色皿/96孔板、研钵/匀浆器/超声破碎仪、蒸馏水和冰。

操作步骤：

一、 样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1、组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

2、细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（10⁴个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

3、液体：直接测定。(若溶液呈现浑浊，则离心取上清后再测定)。

二、测定步骤

1、 可见分光光度计/酶标仪预热30min以上，调节波长至400nm，可见分光光度计用蒸馏水调零。

2、操作表：

混匀后，测定在400nm处的吸光度，记作A_测定，A_对照，A_标准，A_标准空白。∆A_测定=A_测定-A_对照，∆A_标准=A_标准-A_标准空白。（标准管和标准空白管只需做1-2次。）

三、FRAP活性计算

(1) 按样本蛋白浓度计算

单位的定义：每mg组织蛋白每分钟催化产生1nmol酚定义为一个酶活力单位。

FRAP活性（U/mg prot）=(∆A_测定×C_标准÷∆A_标准) ×V_样÷（Cpr×V_样）÷T×10³×F=41.67×∆A_测定÷∆A_标准÷Cpr×F

(2) 按样本质量计算

单位的定义：每g组织每分钟催化产生1nmol酚定义为一个酶活力单位。

FRAP活性（U/g 质量）= (∆A_测定×C_标准÷∆A_标准) ×V_样÷（W÷V_样总×V_样）÷T×10³×F=41.67×∆A_测定÷∆A_标准÷W×F

(3) 按细菌或细胞数目计算

单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟催化产生1nmol酚定义为一个酶活力单位。

FRAP活性（U/10⁴ cell）= (∆A_测定×C_标准÷∆A_标准) ×V_样÷（N÷V_样总×V_样）÷T×10³×F=41.67×∆A_测定÷∆A_标准×F

(4) 按血清（浆）等液体体积计算

单位的定义：每mL血清（浆）等液体每分钟催化产生1nmol酚定义为一个酶活力单位。

FRAP活性（U/mL）= (∆A_测定×C_标准÷∆A_标准) ×V_样÷V_样÷T×10³×F=41.67×∆A_测定÷∆A_标准×F

C_标准：酚标准液，1.25 μmol/mL ；V_样：反应体系中加入的样本体积，0.01mL；V_样总：加入的提取液体积，1mL；T：反应时间，30min；Cpr：蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；10³：单位换算系数，1μmol/mL=10³nmol/mL；N：细胞数量，以万计；F：样本稀释倍数。

注意事项：

1、 如果测定的吸光值或∆A_测定大于1.5，可以对样本进行稀释或者缩短37℃酶促反应时间；测定的吸光值或∆A_测定小于0.01，可以加大样本量或者延长37℃酶促反应时间。最终计算时同步修改计算公式。

实验实例：

1、 称取0.1074g兔子肝脏组织，加入1mL提取液进行冰浴匀浆，将上清液稀释2倍后按照测定步骤操作，用96孔板测得计算∆A_测定=A_测定-A_对照=0.485-0.067=0.418，∆A_标准=A_标准-A_标准空白=0.720-0.070=0.650，带入公式计算：

FRAP活性（U/g 质量）=41.67×∆A_测定÷∆A_标准÷W×F =499.013 U/g 质量

2、 称取0.1057g竹子叶，加入1mL提取液进行冰浴匀浆，按照测定步骤操作，用96孔板测得计算∆A_测定=A_测定-A_对照=0.396-0.110=0.286，∆A_标准=A_标准-A_标准空白=0.720-0.070=0.650，带入公式计算：

FRAP活性（U/g 质量）= 41.67×∆A_测定÷∆A_标准÷W×F =173.461U/g 质量

3、 吸取0.01mL羊血清，按照测定步骤操作，用96孔板测得计算∆A_测定=A_测定-A_对照=0.126-0.070=0.056，∆A_标准=A_标准-A_标准空白=0.720-0.070=0.650，带入公式计算： 

FRAP活性（U/mL）=41.67×∆A_测定÷∆A_标准×F =3.590 U/mL 

参考文献：

[1] Megat R, Wahab A, Dasor M M, et al. Crevicular tartrate resistant acid phosphatase activity and rate of tooth movement under different continuous force applications[J]. African journ al of pharmacy and pharmacology, 2011, 5(20):2213-2219. 

[2] Natasˇa Mitic´, Mohsen Valizadeh, Eleanor W.W. Leung, et al. Human tartrate-resistant acid phosphatase becomes

an effective ATPase upon proteolytic activation [J]. Archives of Biochemistry and Biophysics 439 (2005) 154–164.

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