土壤植酸酶活性检测试剂盒 微量法

土壤植酸酶活性检测试剂盒说明书

微量法

注意：本产品试剂有所变动，请注意并严格按照该说明书操作。

货号：BC5375

规格：100T/48S

产品内容：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

溶液的配制：

1. 试剂一：甲苯，需自备。

2. 试剂二：临用前将试剂二B全部倒入试剂二A中，充分震荡溶解，用不完的试剂2-8℃可保存4周。

3. 试剂三：临用前加入3mL蒸馏水充分溶解，再将枪头伸入液面下缓慢加入0.81mL浓硫酸，用不完的试剂2-8℃可保存4周。

4. 试剂四：临用前加入13mL蒸馏水充分溶解，再加入20μL浓硫酸，用不完的试剂2-8℃可保存4周。

5. 工作液：临用前根据测定数量将试剂三：试剂四=1mL：5mL（约60T，可根据样本量按比例调整）的比例混匀，配制后于2-8℃可保存3天。

6. 标准品：10μmol/mL无机磷标准液。

产品说明：

植酸酶（Phytase）又叫肌醇六磷酸酶，是一种蛋白质和糖的结合酶，植酸酶可以分解植酸产生无机磷和肌醇，极大的提高生物对养分的利用率。土壤植酸酶主要来自于土壤中的微生物，在磷素循环中起着重要作用，土壤植酸酶在土壤改良和农业可持续发展领域具有较强的应用前景。

在一定的环境条件下，土壤植酸酶可以分解植酸钠（肌醇六磷酸十二钠）产生无机磷和肌醇衍生物，在酸性条件下，无机磷和钼酸铵显色剂发生反应，产生蓝色的钼蓝物质，其在700nm有特征吸收峰，通过测定无机磷的含量，可计算出土壤植酸酶的活性。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

酶标仪/可见分光光度计、低温离心机、水浴锅/恒温培养箱、可调式移液器、研钵、30-50目筛、甲苯、浓硫酸、96孔板/微量玻璃比色皿、冰和蒸馏水。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

新鲜土样自然风干或 37℃烘箱风干，过 30~50 目筛。

二、测定步骤

1、酶标仪/可见分光光度计预热30min以上，调节波长至700nm。可见分光光度计用蒸馏水调零。

2、标准溶液的稀释：将10μmol/mL无机磷标准液用蒸馏水稀释至1.25、0.625、0.3125、0.15625、0.078125、0.039、0.02、0.01μmol/mL备用。

3、标准溶液稀释可参考下表：

备注：实验中每个标准管需100µL标准溶液。

4、在离心管中按下表步骤加样：

     室温静置15min，于700nm处测定吸光值，分别记为A测定、A对照、A标准、A空白。分别计算 ΔA测定=A测定-A对照，ΔA标准=A标准-A空白（标准曲线和空白管只需做 1-2 次，每个测定管需设置一个对照管）。

三、土壤植酸酶活性的计算

1. 标准曲线的绘制

根据标准管的浓度（x，μmol/mL）和吸光度ΔA标准（y，ΔA标准），建立标准曲线。根据标准曲线，将ΔA测定（y，ΔA测定）代入公式计算样本浓度（x，μmol/mL）。

2. 土壤植酸酶活性计算

单位定义：37℃下每g土壤每天在反应体系释放1μmol无机磷为1个酶活力单位。

土壤植酸酶活性（U/g）= x×V反总÷W÷T=0.52x÷W

V反：反应体系总体积，0.52mL；W：土壤质量，g；T：反应时间，24h=1d。

注意事项：

1. 为防止沸水浴10min过程中水分散失，建议使用螺旋盖的离心管或用封口膜给EP管缠口。

2. 如果ΔA测定< 0.01，适当延长第一步37℃反应时间或加大样本量后，重新测定。如果ΔA测定＞1.2，建议将上清液用蒸馏水适当稀释后进行测定，注意乘以稀释倍数。

3. 结果于30min内测定完毕，尽量保证所有样本测定时间的一致性。

实验实例：

1.   取0.03g三叶草土壤，按照测定步骤操作，在96孔板中测得A测定 = 0.359，A对照 = 0.28，∆A测定= 0.079，将∆A代入标曲公式y = 1.1104x + 0.0077，得出x= 0.0642，按样本质量计算酶活得：

土壤植酸酶活性（U/g）= 1.113 U/g。

2.   取0.03g蘑菇土土壤，按照测定步骤操作，在96孔板中测得A测定 = 0.442，A对照 = 0.32，∆A测定= 0.122，将∆A代入标曲公式y = 1.1104x + 0.0077，得出x= 0.1029，按样本质量计算酶活得：

土壤植酸酶活性（U/g）= 1.784 U/g。

参考文献：

[1] Berry D F, Shang C, Zelazny L W. Measurement of phytase activity in soil using a chromophoric tethered phytic acid probe[J]. Soil Biology & Biochemistry, 2009, 41(2):192-200.

[2] Marshall, Arebojie, Azeke, et al. Effect of germination on the phytase activity, phytate and total phosphorus contents of rice (Oryza sativa), maize (Zea mays), millet (Panicum miliaceum), sorghum (Sorghum bicolor) and wheat (Triticum aestivum) [J]. Journal of Food Science & Technology, 2011, 48(6):724-729.

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