吡咯啉-5-羧酸还原酶活性检测试剂盒 微量法

吡咯啉-5-羧酸还原酶（P5CR）活性检测试剂盒说明书

微量法

货号：BC5385

规格：100T/48S

产品内容：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

溶液的配制：

1、 提取液二：易挥发试剂，用完及时拧盖封口放回-20℃。

2、 提取液的配制：根据样本量按提取液一：提取液二=0.99mL：0.01mL（1T）的比例配制提取液，现用现配，禁止提前配制。

3、 试剂三：临用前取一支试剂三加入5.6mL试剂一，充分混匀。未用完的试剂分装保存，-20℃保存可以保存4周，避免反复冻融。

4、 标准品：临用前加入 1.4 mL 蒸馏水，即 2 µmol/mL NADH标准液。未用完的试剂分装保存，-20℃可以保存2周，避免反复冻融。临用前取100μL的2 µmol/mL NADH标准液于EP管中，加入700μL蒸馏水充分溶解，配制成0.25μmol/mL的NADH标准液。现用现配。

产品说明：

吡咯啉-5-羧酸还原酶(pyrroline-5-carboxylate reductase，P5CR)是广泛存在于原核和真核生物中的一种重要的管家蛋白。在NAD(P)H的作用下，吡咯啉-5-羧酸(P5C)在吡咯啉-5-羧酸还原酶作用下转化为脯*酸，并且P5CR 还被发现能够在大肠杆菌中参与到硫代脯*酸 (Thioproline) 的代谢过程。

硫代脯*酸在吡咯啉-5-羧酸还原酶催化作用下脱氢，并伴随着NAD转化为NADH。在1-mPMS作用下，WST-1可与NADH 反应，产生水溶性formazan，在450nm下有特征吸收峰

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计/酶标仪、水浴锅/恒温培养箱、可调式移液器、微量玻璃比色皿/96孔板、研钵/匀浆器/细胞超声破碎仪、蒸馏水和冰。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1、组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

2、细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（10⁴个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

3、血清（浆）等液体：直接测定。(若溶液呈现浑浊，则离心取上清后再测定)。

二、测定步骤

1、 可见分光光度计/酶标仪预热30min以上，调节波长至450nm，可见分光光度计用蒸馏水调零。

2、操作表：

充分混匀，37℃反应显色30min，取200μL于微量玻璃比色皿或96孔板中，测定在450nm处的吸光度。记作A_测定，A_对照，A_标准，A_空白。ΔA_测定=A_测定-A_对照，ΔA_标准=A_标准-A_空白。（标准管和空白管只需做1-2次。）

三、P5CR活性计算

(1) 按样本蛋白浓度计算

单位的定义：每mg组织蛋白每分钟催化产生1nmol NADH定义为一个酶活力单位。

P5CR活性（U/mg prot）=(ΔA_测定×C_标准÷ΔA_标准) ×V_样÷（Cpr×V_样）÷T×10³×F=8.333×ΔA_测定÷ΔA_标准÷Cpr×F

(2) 按样本质量计算

单位的定义：每g组织每分钟催化产生1nmol NADH定义为一个酶活力单位。

P5CR活性（U/g 质量）= (ΔA_测定×C_标准÷ΔA_标准) ×V_样÷（W÷V_样总×V_样）÷T×10³×F=8.333×ΔA_测定÷ΔA_标准÷W×F

(3) 按细菌或细胞数目计算

单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟催化产生1nmol NADH定义为一个酶活力单位。

P5CR活性（U/10⁴ cell）= (ΔA_测定×C_标准÷ΔA_标准) ×V_样÷（500÷V_样总×V_样）÷T×10³×F=0.0167×ΔA_测定÷ΔA_标准×F

(4) 按血清（浆）等液体体积计算

单位的定义：每mL血清（浆）等液体每分钟催化产生1nmol NADH定义为一个酶活力单位。

P5CR活性（U/mL）= (ΔA_测定×C_标准÷ΔA_标准) ×V_样÷V_样÷T×10³×F=8.333×ΔA_测定÷ΔA_标准×F

C_标准: NADH标准液的浓度，0.25μmol/mL；V_样：反应体系中加入的样本体积，0.02mL；V_样总：加入的提取液体积，1mL；T：反应时间，30min；Cpr：蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细胞或细菌数目，500万；10³：单位换算系数，1μmol/mL=10³nmol/mL；F：样本稀释倍数。

注意事项：

1. 如果A_测定大于1.8或者∆A_测定大于1，可以减少样品量或者缩短反应时间；若∆A_测定小于0.01，可以加大样品量或者延长反应时间至1h或者更长时间。计算公式注意同步修改

实验实例：

1、 称取0.0993g橙子叶，加入提取液进行冰浴匀浆，按照测定步骤操作，用96孔板测得计算ΔA_测定=A_测定-A_对照=0.318-0.288=0.03，ΔA_标准=A_标准-A_空白=0.538-0.181=0.357，带入公式计算：

P5CR活性(U/g 质量)= 8.333×ΔA_测定÷ΔA_标准÷W×F =8.333×0.03÷0.357÷0.0993=7.052 U/g 质量

2、 称取0.1006g小鼠肾脏组织，加入提取液进行冰浴匀浆，按照测定步骤操作，用96孔板测得计算ΔA_测定=A_测定-A_对照=0.369-0.274=0.095，ΔA_标准=A_标准-A_空白=0.538-0.181=0.357，带入公式计算：

P5CR活性(U/g 质量)= 8.333×ΔA_测定÷ΔA_标准÷W×F =8.333×0.095÷0.357÷1.006=22.042 U/g 质量

3、 吸取0.02mL羊血清，按照测定步骤操作，用96孔板测得计算ΔA_测定=A_测定-A_对照=0.299-0.146=0.153，ΔA_标准=A_标准-A_空白=0.538-0.181=0.357，带入公式计算： 

P5CR活性(U/mL)= 8.333×ΔA_测定÷ΔA_标准÷W×F =8.333×0.153÷0.357=3.571 U/mL

参考文献：

FENG Chang-Z, XIE Y H, CAO Y, et al. Expression, Purification and Physicochemical Characteristics of Pyrroline-5-Carboxylic Acid Reductase in Drosophila[J]. Chinese Journal of Biological Engineering, 2012, 32(6):8. 

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