谷*酰胺（Gln）含量检测试剂盒

谷*酰胺（Gln）含量检测试剂盒

微量法

货号：BC5305

规格：100T/48S

产品内容：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

溶液的配制：

1. 提取液二：氯仿，需自备。

2. 试剂二：试剂质量很小，有可能肉眼观察不到，直接使用即可。临用前取一支加入0.2mL蒸馏水，-20℃分装可保存4周，避免反复冻融。

3. 试剂二工作液：根据样本量按试剂二：蒸馏水=0.05mL：0.7mL（约18S）的比例进行稀释，现用现配，使用时置于冰上。

4. 试剂四：临用前加入20mL提取液一，用不完的试剂分装后-20℃可保存4周。避免反复冻融。

5. 试剂五：临用前加入1.5mL试剂一，用不完的试剂分装后-20℃可保存4周。避免反复冻融，使用时置于冰上。

6. 标准品：10μmol/mL谷*酰胺标准液。

产品说明：

谷*酰胺（Glutamine）简称Gln，是谷*酸的酰胺，是组成蛋白质的重要氨基酸之一。同时谷*酰胺也是三羧酸循环中α-酮戊二酸的主要来源。谷*酰胺在生物体内以游离态和结合态两种状态存在，游离的谷*酰胺是在生物体代谢中起着重要作用，其代谢占细胞和血液循环中自由氨基酸的60%以上。

游离谷*酰胺在谷*酰胺酶的催化作用下转变为谷*酸，谷*酸脱氢酶（GDH）催化谷*酸和NAD生成α-酮戊二酸、NADH和NH₄⁺，在1-mPMS作用下，WST可与NADH反应，产生水溶性formazan，其在450nm处有最大吸收峰，据此可计算谷*酰胺含量。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。 

需自备的仪器和用品：

酶标仪/可见分光光度计、低温离心机、水浴锅/恒温培养箱、可调式移液器、研钵/匀浆器/细胞超声破碎仪、氯仿、96孔板/微量玻璃比色皿、冰和蒸馏水。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1. 组织：按照样本质量（g）：提取液一体积（mL）为1:5~10 的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液一）加入提取液一，冰浴匀浆；12000g 4℃离心5min，取上清加入500µL提取液二，剧烈振荡5min，12000g 4℃离心5min，取上层液体（呈清澈状态）置冰上待测（中层浑浊物质和下层液体不需要）。

2. 细菌或细胞样本：收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清，按照细菌或细胞数量（10⁴个）：提取液一体积（mL）为 500~1000:1 的比例（建议500万细菌或细胞加入 1mL 提取液一）加入提取液一，超声波破碎细菌或细胞（温度4℃，功率200W，超声 3s，间隔 7s，总时间3min），12000g 4℃离心5min，取上清加入500µL提取液二，剧烈振荡5min，12000g 4℃离心5min，取上层液体（呈清澈状态）置冰上待测（中层浑浊物质和下层液体不需要）。

3. 血清（浆）等液体样本：取500µL样本加入500µL提取液二（若溶液浑浊则需先离心后取上清），剧烈振荡5min，12000g 4℃离心5min，取上层液体（呈清澈状态）置冰上待测（中层浑浊物质和下层液体不需要）。

注：如果需要测蛋白浓度，需在加提取液二之前测定蛋白浓度。

二、测定步骤

1、酶标仪/可见分光光度计预热30min以上，调节波长至450nm，可见分光光度计用蒸馏水调零。

2、0.4μmol/mL标准溶液的稀释：取40μL 10μmol/mL谷*酰胺标准液，加入960μL蒸馏水，充分混匀，配制成0.4μmol/mL标准溶液使用，现用现配。（实验中每管需要40μL，为减小实验误差，故配制大体积。）

3、在EP管中按下表步骤加样：

     37℃避光反应1h，12000g 常温离心5min，吸取200μL上清，于450nm处测定吸光值，分别记为A_测定、A_对照、A_标准、A_空白。分别计算ΔA_测定=A_测定-A_对照，ΔA_标准=A_标准-A_空白（标准管和空白管只需做1-2次，每个测定管需设置一个对照管）。ΔA_测定的测定范围在0.005-0.7之间。

三、谷*酰胺含量的计算

（1）按样本蛋白质浓度计算（蛋白浓度需自行测定）：

谷*酰胺含量（μmol/mg prot）= ΔA_测定×C_标准÷ΔA_标准×V样总÷（Cpr×V样总）= ΔA_测定×0.4÷ΔA_标准÷Cpr

（2）按样本质量计算：

谷*酰胺含量（μmol/g 质量）= ΔA_测定×C_标准÷ΔA_标准×V样总÷W=ΔA_测定×0.4÷ΔA_标准÷W

（3）按细菌/细胞数量计算：

谷*酰胺含量（μmol/10⁴cell）= ΔA_测定×C_标准÷ΔA_标准×V样总÷N= ΔA_测定×0.4÷ΔA_标准÷N

（4）按照液体样本体积计算：

谷*酰胺含量（μmol/mL）= ΔA_测定×C_标准÷ΔA_标准= ΔA_测定×0.4÷ΔA_标准

C_标准：标准溶液浓度，0.4μmol/mL；V样总：加入提取液一之后的样本体积，1mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；N：细胞数量，万个。

注意事项：

1、 如果需要测蛋白浓度，需在加提取液二之前测定蛋白浓度。

2、 如果离心后待测的上清依然浑浊，可尝试加大离心转速或者延长时间，例如12000g 4℃离心5min。

3、 ΔA测定的测定范围在0.005-0.7之间。如果测定吸光值超过线性范围吸光值，可以用蒸馏水稀释样本后再次测定，如果测定吸光值小于线性范围吸光值，需要增加样本量后再次测定，注意同步计算公式。

实验实例：

1. 取0.1011g草莓，将样本进行前处理，用蒸馏水稀释2倍后按照测定步骤操作，96孔板测得计算A_测定 = 0.37，A_对照 = 0.1，∆A_测定= 0.27，A_标准=0.466，A_空白=0.094，ΔA_标准=0.372。按样本质量计算Gln含量得：

谷*酰胺含量（μmol/g 质量）=ΔA_测定×0.4÷ΔA_标准÷W×2=5.7433μmol/g 质量。

2. 取0.1081g兔肌肉，将样本进行前处理，用蒸馏水稀释2倍后按照测定步骤操作，96孔板测得计算A_测定 = 0.349，A_对照 = 0.147，∆A_测定= 0.202，A_标准=0.466，A_空白=0.094，ΔA_标准=0.372。按样本质量计算Gln含量得：

谷*酰胺含量（μmol/g 质量）=ΔA_测定×0.4÷ΔA_标准÷W×2=4.0186μmol/g 质量。

3. 取0.5mL羊血清，将样本用蒸馏水稀释2倍后按照测定步骤操作，96孔板测得计算A_测定 = 0.155，A_对照 = 0.118，∆A_测定= 0.037，A_标准=0.466，A_空白=0.094，ΔA_标准=0.372。按样本质量计算Gln含量得：

谷*酰胺含量（μmol/mL）=ΔA_测定×0.4÷ΔA_标准÷W×2=0.0796μmol/mL。

参考文献：

[1] Tsao M, Otter D E. Quantification of glutamine in proteins and peptides using enzymatic hydrolysis and reverse-phase high-performance liquid chromatography[J]. Analytical Biochemistry, 1999, 269(1):143-148.

[2] Seegmiller J E, Schwartz R, Davidson C S. The plasma ammonia and glutamine content in patients with hepatic coma[J]. Journal of Clinical Investigation, 1954, 33(7), 984.

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