低密度脂蛋白胆*醇含量检测试剂盒 微量法

低密度脂蛋白胆*醇（LDL-C）含量检测试剂盒说明书

微量法

注意：本产品试剂有所变动，请注意并严格按照该说明书操作。

货号：BC5335

规格：100T/96S

产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

溶液的配制：

1. 提取液：自备异丙醇，大约需要110mL，常温保存；试剂盒内提供一个30mL棕色空瓶，仅做分装使用，请自行标注试剂名称。

2. 试剂一C：液体置于试剂瓶内EP管中。

3. 试剂一的配制：根据样本量将试剂一A：试剂一B：试剂一C按2.25 mL：20 μL：3 μL（2.273mL，约12T）的比例进行配制，现用现配，当天用完。

4. 标准品：10 mg胆*醇，临用前加入517 μL提取液，振荡溶解，即为50 μmol/mL的胆*醇标准溶液，2-8℃可保存4周。

产品说明：

产品说明：

低密度脂蛋白是血清脂蛋白中胆*醇含量最高的一种脂蛋白，其颗粒较小，主要作用是将肝脏组织的胆*醇经过血液转运至其他组织，促进组织细胞中胆*醇的积累。众多流行病学研究表明，血清低密度脂蛋白胆*醇（Low-Density Lipoprotein Cholesterol，LDL-C）水平与动脉粥样硬化（AS）、冠心病（GHD）呈正相关，对于临床诊断动脉粥硬化、冠心病、高血压等疾病有重要参考价值。

使用选择性表面活性剂，特异性解离出CM、VLDL、HDL中的胆*醇，而不作用于LDL，解离出的胆*醇与胆*醇酯酶(CHER)和胆*醇氧化酶(CHOD)反应产生H₂O₂，在缺乏显色剂的情况下被消耗掉而不显色；未被分解的LDL在另一特异性表面活性剂的作用下解离，利用酯酶催化胆*醇酯水解生成游离胆*醇（FC）和游离脂肪酸（FFA），从而把胆*醇酯转化为FC；进一步利用胆*醇氧化酶催化FC氧化，生成4-胆甾烯酮和H₂O₂；最后利用过氧化物酶催化H₂O₂氧化4-氨基*替比林和苯胺类似物，生成紫色化合物，其在546nm有特征吸收峰。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者

增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计/酶标仪、天平、低温离心机、水浴锅/恒温培养箱、微量玻璃比色皿/96孔板、研钵/匀浆器/细胞超声破碎仪、可调式移液枪、冰、蒸馏水、异丙醇（AR）。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1. 组织：按照组织质量（g）：提取液体积（mL）为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液）进行冰浴匀浆。10000g，4℃离心10min，取上清置冰上待测。

2. 细菌/细胞：按照细胞数量（10⁴个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率300W，超声2秒，间隔3秒，总时间3min）；然后10000g，4℃离心10min，取上清置于冰上待测。

3. 血清（浆）等液体样本：直接测定。若有沉淀请离心后取上清待测。

二、测定步骤

1. 可见分光光度计/酶标仪预热30min以上，调节波长至546nm，分光光度计蒸馏水调零。

2. 根据样本量取试剂一、试剂二37℃预热10min。

3. 标准溶液的稀释：将50μmol/mL胆*醇标准溶液用提取液进行稀释得到2.5、1.25、0.625、0.3125、0.15625、0.078125、0.0390625μmol/mL的标准溶液备用。

4. 标准溶液稀释可参考下表：（实验中每个标准管需5µL标准溶液）

5. 在96孔板或微量玻璃比色皿中按下表步骤加样：

充分混匀，37℃静置5min，测定546nm处吸光值A2，分别记为A2测定、A2标准、A2空白，计算∆A测定=（A2测定-A1测定）-（A2空白-A1空白），∆A标准=（A2标准-A1标准）-（A2空白-A1空白）。空白管和标准曲线只需测1-2次。

注：若样本为血清（浆）等液体样本，则需要增加‘血清（浆）空白管’-即将空白管中的提取液（异丙醇）更换为蒸馏水进行实验，计算ΔA测定=A测定-A血清（浆）空白，标准管测定及ΔA标准计算不变。

三、低密度脂蛋白胆*醇含量计算

1. 标准曲线的绘制：

根据标准管的浓度（x，μmol/mL）和吸光度ΔA标准（y，ΔA标准），建立标准曲线。根据标准曲线，将ΔA测定（y，ΔA测定）带入公式计算样本浓度（x，μmol/mL）。

2. LDL-C含量的计算：

（1）按血清（浆）等液体体积计算：

LDL-C含量（μmol/dL）=x×100

（2）按样本蛋白浓度计算：

LDL-C含量（μmol/mg prot）=x×V样本÷（Cpr×V样本）=x÷Cpr

（3）按样本质量计算：

LDL-C含量（μmol/g 质量）=x×V样本÷（W×V样本÷V提取）=x÷W

（4）按细胞/细菌数量计算：

LDL-C含量(μmol /10⁴ cell)=x×V样本÷（N×V样本÷V提取）= x÷N

100：单位换算系数，1dL=100mL；V样本: 加入样本上清的体积，0.005mL；V提取：加入提取液的体积，1mL；Cpr：蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；N：细菌或细胞总数，以万计。

注意事项：

1. 如果测定吸光值超出线性范围吸光值，可以增加样本量或者用提取液稀释样本（液体样本用蒸馏水稀释）上清后再进行测定。注意同步修改计算公式。

2. 提取液中含有使蛋白变性的成分，故按蛋白浓度计算时需要重新提取蛋白进行测定。

实验实例：

1、 取5μL人血清样本，按照测定步骤操作，使用96孔板测得计算ΔA测定=（A2测定-A1测定）-（A2空白-A1空白）=（0.515-0.061）-（0.056-0.055）=0.453，根据标准曲线y=0.1163x-0.0039，计算x=3.929，按血清（浆）等液体体积计算：

LDL-C含量（μmol/dL）=x×100=3.929×100=392.863 μmol/dL。

2、 取0.11g小鼠肝脏样本，加入1mL提取液，冰浴匀浆，离心后取上清按照测定步骤操作，使用96孔板测得计算，ΔA测定=（A2测定-A1测定）-（A2空白-A1空白）=（0.239-0.056）-（0.056-0.055）=0.182，根据标准曲线y=0.1163x-0.0039，计算x=1.598，按样本质量计算：

LDL-C含量（μmol/g 质量）=x÷W=1.598÷0.11=14.531 μmol/g 质量。

参考文献：

[1] Hiroyuki S, Tetsumi I, Yoshinori U, et al. Homogeneous assay for measuring low-density lipoprotein cholesterol in serum with triblock copolymer and α-cyclodextrin sulfate[J]. Clinical Chemistry, 1998, 44(3):522-531.

[2] Sakaue T, Hirano T, Yoshino G, et al. Reactions of direct LDL-cholesterol assays with pure LDL fraction and IDL: comparison of three homogeneous methods [J]. Clinica Chimica Acta, 2000, 295(1-2):97-106.

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