高密度脂蛋白胆*醇含量检测试剂盒 微量法

高密度脂蛋白胆*醇（HDL-C）含量检测试剂盒说明书

微量法

注意：本产品试剂有所变动，请注意并严格按照该说明书操作

货号：BC5325

规格：100T/96S

产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

溶液的配制：

1. 提取液一：自备异丙醇，大约需要110mL，常温保存；试剂盒内提供一个30mL棕色空瓶，仅做分装使用，请自行标注试剂名称。

2. 提取液二：临用前根据样本量按提取液二A：提取液二B=50μL：50μL（约1T）的比例配制成提取液二，当天用完。

3. 试剂四：液体置于试剂瓶内EP管中。

4. 标准品：10 mg胆*醇，临用前加入517 μL提取液一，振荡溶解，即为50 μmol/mL的胆*醇标准溶液。

5. 工作液的配制：根据样本量按试剂一：试剂二：试剂三：试剂四=0.21mL：2.79mL：20 μL：3 μL（共3.023mL，约16T）的比例配制工作液，现用现配。

产品说明：

高密度脂蛋白（High-Density Lipoprotein Cholesterol，HDL-C）是血清脂蛋白中密度最大、颗粒最小的脂蛋白，主要作用为将周围组织的胆*醇运送到肝脏进行降解。众多流行病学研究表明，HDL-C水平与动脉粥样硬化（AS）、冠心病（GHD）呈负相关，对于临床诊断动脉粥硬化、冠心病、高血压等疾病有重要参考价值。

使用选择性沉淀剂将HDL-C特异性分离出来，利用酯酶催化胆*醇酯水解生成游离胆*醇（FC）和游离脂肪酸（FFA），从而把胆*醇酯转化为FC；进一步利用胆*醇氧化酶催化FC氧化，生成4-胆甾烯酮和H₂O₂；最后利用过氧化物酶催化H₂O₂氧化4-氨基安*比林和苯胺类似物，生成紫色化合物，其在546nm有特征吸收峰，其颜色深浅与HDL-C含量成正比。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计/酶标仪、天平、低温离心机、水浴锅/恒温培养箱、微量玻璃比色皿/96孔板、研钵/匀浆器/细胞超声破碎仪、可调式移液枪、冰、蒸馏水、异丙醇。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1. 组织：按照组织质量（g）：提取液一体积（mL）为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液一）进行冰浴匀浆。10000g，4℃离心10min，取上清置冰上待测。

2. 细菌/细胞：按照细胞数量（10⁴个）：提取液一体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL提取液一），冰浴超声波破碎细胞（功率300W，超声2秒，间隔3秒，总时间3min）；然后10000g，4℃离心10min，取上清置于冰上待测。

3. 血清（浆）等液体样本：直接测定。若有沉淀请离心后取上清待测。

二、测定步骤

1. 可见分光光度计/酶标仪预热30min以上，调节波长至546nm，分光光度计蒸馏水调零。

2. 标准溶液的稀释：将50μmol/mL胆*醇标准溶液用提取液一进行稀释得到2.5、2、1.25、0.625、0.3125、0.15625μmol/mL的标准溶液备用。

3. 标准溶液稀释可参考下表：

备注：实验中每个标准管需100µL标准溶液。

4. 在1.5mLEP管按下表步骤加样：

充分混匀，37℃静置1h，反应完成后测定546nm处吸光值A，分别记为A测定、A标准和A空白，ΔA测定=A测定-A空白，ΔA标准=A标准-A空白。空白管和标准曲线只需测1-2次。

注：若样本为血清（浆）等液体样本，则需要增加‘血清（浆）空白管’-即将空白管中的提取液一（异丙醇）更换为蒸馏水进行实验，计算ΔA测定=A测定-A血清（浆）空白，标准管测定及ΔA标准计算不变。

三、高密度脂蛋白胆*醇含量计算

1. 标准曲线的绘制：

根据标准管的浓度（x，μmol/mL）和吸光度ΔA标准（y，ΔA标准），建立标准曲线。根据标准曲线，将ΔA测定（y，ΔA测定）带入公式计算样本浓度（x，μmol/mL）。

2. HDL-C含量的计算：

（1）按血清（浆）等液体体积计算：

HDL-C含量（μmol/dL）=x×100

（2）按样本蛋白浓度计算：

HDL-C含量（μmol/mg prot）=x×V提取÷（Cpr×V提取）=x÷Cpr

（3）按样本质量计算：

HDL-C含量（μmol/g 质量）=x×V提取÷W=x÷W

（4）按细胞/细菌数量计算：

HDL-C含量(μmol/10⁴ cell)=x×V提取÷N=x÷N

100：单位换算系数，1dL=100mL；V提取：加入提取液一的体积，1mL；W：样本质量，g；N：细菌或细胞总数，以万计。

注意事项：

1. 如果测定吸光值超过线性范围吸光值，可以增加样本量或者用提取液一稀释样本后再进行测定。注意同步修改计算公式。

2. 提取液一中含有使蛋白变形的成分，故按蛋白浓度计算时需要重新提取蛋白进行测定。

实验实例：

1、 取0.1mL人血清样本，按照测定步骤操作，使用96孔板测得计算ΔA测定=A测定-A空白=0.142-0.060=0.082，根据标准曲线y=0.3888x-0.0502，计算x=0.340，按血清（浆）等液体体积计算：

HDL-L含量（μmol/dL）=x×100=0.340×100=34.002 μmol/dL。

2、 取0.1g鱼肝样本，加入1mL提取液一，冰浴匀浆，离心后取上清按照测定步骤操作，使用96孔板测得计算ΔA测定=A测定-A空白=0.089-0.060=0.029，根据标准曲线y=0.3888x-0.0502，计算x=0.204，按样本质量计算：

HDL-L含量（μmol/g 质量）=x÷W=0.204÷0.1=2.037 μmol/g 质量。

参考文献：

[1] Warnick G R, Nauck M, Rifai N I. Evolution of Methods for Measurement of HDL-Cholesterol: From Ultracentrifugation to Homogeneous Assays[J]. Clinical Chemistry, 2001, 47(9):1579-1596.

[2] Yan S, Lin Q. Methods for Detection of High-Density Lipoprotein Cholesterol and its Standardization[J]. Chinese Journal of Laboratory Medicine, 1998, 21(1): 19-22.

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