植酸酶活性检测试剂盒 微量法

植酸酶活性检测试剂盒

微量法

货号：BC3145

规格：100T/48S

产品内容：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

溶液的配制：

1. 试剂一：临用前加入到缓冲液中（可吸取缓冲液到试剂一瓶中反复冲洗），充分震荡溶解，用不完的试剂2-8℃可保存4周。

2. 试剂二：临用前加入3.15mL蒸馏水充分溶解，再将枪头伸入液面下缓慢加入0.85mL浓硫酸，2-8℃可保存4周。

3. 试剂三：临用前加入20mL蒸馏水充分溶解，2-8℃可保存4周。。

4. 工作液：临用前根据测定数量将试剂二：试剂三=1mL：5mL (约40T)的比例混匀，配制后于2-8℃可保存3天。

5. 标准品：5μmol/mL无机磷标准液。

产品说明：

植酸酶（Phytase）又叫肌醇六磷酸酶，是一种蛋白质和糖的结合酶，植酸酶可以分解植酸产生无机磷和肌醇，极大的提高生物对养分的利用率，天然植酸酶广泛存在于植物、动物组织和微生物中，现多用微生物来合成植酸酶进行生产应用，植酸酶在粮食生产、畜牧养殖领域具有广泛的研究价值。

在一定的环境条件下，植酸酶可以分解植酸钠（肌醇六磷酸十二钠）产生无机磷和肌醇衍生物，在酸性条件下，无机磷和钼酸铵显色剂发生反应，产生蓝色的钼蓝物质，其在700nm有特征吸收峰，通过测定无机磷的含量，可计算出植酸酶的活性。 

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计/酶标仪、低温离心机、水浴锅/恒温培养箱、可调式移液器、研钵/匀浆器/细胞超声破碎仪、浓硫酸、微量玻璃比色皿/96孔板、冰和蒸馏水。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1. 组织：按照样本质量（g）：提取液体积（mL）为1:5~10 的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液）加入提取液，冰浴匀浆；4000g 4℃离心10min（若仍然浑浊，可延长离心时间），取上清置冰上待测。

2. 细菌或细胞样本：收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清，按照细菌或细胞数量（10⁴个）：提取液体积（mL）为 500~1000:1 的比例（建议500万细菌或细胞加入 1mL 提取液）加入提取液，超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率200W，超声 3s，间隔 7s，总时间3min），4000g 4℃离心10min，取上清置冰上待测。

3. 培养液或其他液体：直接检测。若溶液浑浊则离心后取上清进行测定。

二、测定步骤

1、可见分光光度计/酶标仪预热30min以上，调节波长至700nm，可见分光光度计用蒸馏水调零。

2、标准溶液的稀释：将5μmol/mL无机磷标准液用蒸馏水稀释至5、3、1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125μmol/mL备用。

3、标准溶液稀释可参考下表：

备注：实验中每个标准管需50µL标准溶液。

4、在EP管中按下表步骤加样：

     常温静置10min，8000g，室温离心10min，吸取200μL上清，于700nm处测定吸光值，分别记为A_测定、A_对照、A_标准、A_空白。分别计算 ΔA=A_测定-A_对照，ΔA标准=A_标准-A_空白（标准曲线和空白管只需做 1-2 次，每个测定管需设置一个对照管）。

二、植酸酶活性的计算

1. 标准曲线的绘制

根据标准管的浓度（x，μmol/mL）和吸光度ΔA标准（y，ΔA标准），建立标准曲线。根据标准曲线，将ΔA（y，ΔA）代入公式计算样本浓度（x，μmol/mL）。

2. 植酸酶活性计算

（1）按样本蛋白质浓度计算

单位定义：在37℃，pH5.5环境下，每mg组织蛋白每分钟在反应体系释放1μmol无机磷为1个酶活力单位。

植酸酶活性（U/mg prot）= x×V样总÷（Cpr×V样总）÷T= x÷Cpr÷30；

（2）按样本质量计算

单位定义：在37℃，pH5.5环境下，每g组织每分钟在反应体系释放1μmol无机磷为1个酶活力单位。

植酸酶活性（U/g 质量）= x×V样总÷W÷T=x÷W÷30；

（3）按细菌/细胞数量计算

单位定义：在37℃，pH5.5环境下，每10⁴个细胞每分钟在反应体系释放1μmol无机磷为1个酶活力单位。

植酸酶活性（U/10⁴cell）=  x×V样总÷N÷T= x÷N÷30；

（4）按照液体样本体积计算

单位定义：在37℃，pH5.5环境下，每mL样本每分钟在反应体系释放1μmol无机磷为1个酶活力单位。

植酸酶活性（U/mL）= x×V样÷V样÷T= x÷30；

V样：加入样本体积，0.05mL；V样总：提取液体积，1mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；T：反应时间，30min；N：细胞数量，以万计。

注意事项：

1. 为防止沸水浴10min过程中水分散失，建议使用螺旋管或用封口膜给EP管缠口。

2. 如果测定吸光值过低或接近空白，适当延长反应时间或加大样本量后，重新测定。如果A_测定大于1.5或者ΔA超过检测范围，建议将样本用蒸馏水进行适当稀释后进行测定。注意同步修改计算公式。

3. 结果于40min内测定完毕。

实验实例：

取0.15g菠菜种子（已发芽），按照测定步骤操作，测得计算A_测定 = 0.692，A_对照 = 0.573，∆A= 0.119，将∆A代入标曲公式y = 0.2991x + 0.0121，得出x= 0.357，按样本质量计算酶活得：

植酸酶活性（U/g 质量）= 0.0794 U/g 质量。

参考文献：

[1] Senna R , Simonin V , Silva-Neto M A C , et al. Induction of acid phosphatase activity during germination of maize (Zea mays) seeds.[J]. Plant Physiology & Biochemistry, 2006, 44(7-9):467-473.

[2] Iqbal T H , Lewis K O , Cooper B T . Phytase activity in the human and rat small intestine[J]. Gut, 1994, 35(9):1233-1236.

[3] Azeke M A ,  Egielewa S J ,  Ihimire E . Effect of germination on the phytase activity, phytate and total phosphorus contents of rice (Oryza sativa), maize (Zea mays), millet (Panicum miliaceum), sorghum (Sorghum bicolor) and wheat (Triticum aestivum)[J]. Journal of Food Science&Technology, 2011.

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