植物根系活力（TTC法）检测试剂盒 微量法

植物根系活力检测试剂盒（TTC法）说明书

微量法

货号：BC5275

规格：100T/48S

产品内容：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

溶液的配制：

1、 试剂一：临用前取一支试剂一B加入一瓶试剂一A中，加入30mL试剂二溶解。现用现配。配制好后置于2-8℃，一周内使用，若出现红色，则不能使用。

2、 试剂二：若试剂有结晶析出，可40℃加热或者超声溶解。

3、 试剂四：乙酸乙酯，自备。提供一125mL 空瓶。

4、 标准品：临用前加入1mL试剂二，充分震荡混匀, 即10mg/mL TTC标准液。2-8℃可以保存1周，若出现红色，则不能使用。

产品说明：

根系是植物吸收水分和矿质营养的主要器官，同时又是植物体中重要物质如氨基酸、激素等物质合成、同化、转化的器官，因此根的生长情况和活动能力直接影响植物个体的生长情况、营养水平和产量水平等，根系活力具有重要的实际意义。

TTC可被氢还原成不溶性的红色三苯基甲臜（TTF），TTF在485nm处有吸收峰。当TTC溶液渗入到植物根部组织时，呼吸过程产生的还原物质可将其还原成TTF(红色)，植物根部组织被染成红色。根系活力强弱可用TTC的还原量来表示。此方法检测的根系活力即植物根系的脱氢酶活性。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计/酶标仪、水浴锅/恒温培养箱、台式离心机、可调式移液器、微量玻璃比色皿/96孔板(非聚苯乙烯材质)、研钵/匀浆器、乙酸乙酯，冰和蒸馏水。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

样本的制备：将根部组织洗净，去除根上的泥土，轻轻擦干，不要过分挤压破坏根系细胞。

二、测定步骤

1、 可见分光光度计/酶标仪预热30min以上，调节波长至485nm，可见分光光度计用乙酸乙酯调零。

2、 标准溶液的稀释：

（1） 临用前取10μL 10mg/mL TTC标准液，加入1990μL试剂二，充分混匀，配制成50μg/mL TTC标准溶液，现用现配。（后续实验需要1000μL，为减小实验误差，故配制大体积。）

（2） 取1mL 50 μg/mL TTC标准溶液加入到一支试剂三内，充分震荡混匀2min。混匀后加入1mL乙酸乙酯，再次充分震荡混匀2min，室温静置分层5min，取上层溶液。

（3） 将上层溶液用乙酸乙酯进行稀释，得到20μg/mL标准溶液备用（吸取200μL 50 μg/mL TTC加入300μL乙酸乙酯混匀即可）。

3、标准溶液的测定

取200μL 20μg/mL标准溶液和200μL乙酸乙酯（即0μg/mL）于微量玻璃比色皿或96孔板(非聚苯乙烯材质)中，分别测定其在485nm处的吸光度。计算ΔA标准= A_{（20μg/mL）}-A_{（0μg/mL）}。ΔA标准只需做1-2次。

4、在2mL EP管按下表步骤加样：

充分研磨（建议在通风橱操作）后全部移至于离心管中，12000 rpm，4℃，离心 10min，取 200μL 上清至微量玻璃比色皿或96孔板(非聚苯乙烯材质)中，测定 485nm下的吸光值。计算ΔA测定=A测定-A对照（标准曲线只需做1-2次，每一个测定管对应一个对照管）。ΔA测定的测定范围在0.005-1.5之间。

三、根系活力计算

按照样本质量计算根系活力：以TTC的还原量来表示根系活力

TTC还原强度 [ μg TTC/(g·h) ] =ΔA测定×C标÷ΔA标准×V÷ (W×T)=5×ΔA测定÷ΔA标准÷W

W：根重，g；C标：标准溶液浓度，20μg/mL；T：反应时间，4h；V：试剂四的体积即匀浆体积，1mL。

注意事项：

1、 试剂四容易挥发，有毒，为了您的健康，请穿实验服，戴口罩，戴乳胶手套操作。

2、 若样品37℃暗反应未到4h但根系已出现深粉色，此时可以直接进行下一步实验操作；若ΔA测定大于1.5，可以减少样本质量或者缩短反应时间进行实验，计算公式注意修改。

3、 若4h暗反应结束后，根系没有出现粉色或者ΔA测定小于0.005，可以延长暗反应时间（8h，16h甚至24h）或者加大样品量，计算公式注意修改。

4、 如果离心后待测的上清依然浑浊，可尝试加大离心转速或者延长时间，例如15000rpm 4℃离心20min。

实验实例：

1、 称取0.131g葱的根部，洗净，擦干，按照测定步骤操作，用96孔板（非聚苯乙烯材质）测得计算ΔA测定=A测定-A对照=0.714-0.082=0.632，ΔA标准= A_{（20μg/mL）}-A_{（0μg/mL）}=0.660-0.042=0.618，带入公式计算：

TTC还原强度=5×ΔA测定÷ΔA标准÷W =39.033 μg TTC/(g·h)

2、 称取0.126g景天的根部，洗净，擦干，按照测定步骤操作，用96孔板（非聚苯乙烯材质）测得计算ΔA测定=A测定-A对照=0.422-0.139=0.283，ΔA标准= A_{（20μg/mL）}-A_{（0μg/mL）}=0.660-0.042=0.618，带入公式计算：

TTC还原强度=5×ΔA测定÷ΔA标准÷W =18.172 μg TTC/(g·h)

3、 称取0.118g蒜的根部，洗净，擦干，按照测定步骤操作，用96孔板（非聚苯乙烯材质）测得计算ΔA测定=A测定-A对照=0.191-0.055=0.136，ΔA标准= A_{（20μg/mL）}-A_{（0μg/mL）}=0.660-0.042=0.618，带入公式计算：

TTC还原强度=5×ΔA测定÷ΔA标准÷W =9.325 μg TTC/(g·h)

参考文献：

[1] Xiuyun Zhu, Meng Liang,Yu Ma. A Review Report on the Experiments for the Determination of Root Activity by TTC Method[J]. Guangdong Chemical Industry, 2020

[1] Sangen Wang. Plant Physiology Experiment Course[M]. Science Press, 2005.

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