α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶活性测试盒 糖代谢

α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶（α-L-Af）活性检测试剂盒说明书

可见分光光度法

货号：BC4760

规格：50T/24S

产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

溶液的配制：

1、试剂一：临用前取1瓶加入2.667mL蒸馏水，充分溶解，用不完的试剂建议分装后-20℃保存2周，避免反复冻融。

2、标准品：5 µmol/mL的对-硝基苯*溶液。

产品说明：

α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶（α-L-Arabinofuranosidase，α-L-Af）属于糖基水解酶家族，可以从含有阿拉伯糖残基的多聚物如阿拉伯木聚糖、阿拉伯聚糖和阿拉伯半乳聚糖等的非还原末端水解生成一个L-阿拉伯糖分子。该酶在半纤维素降解以及果实的成熟软化过程中有着重要作用。

α-L-Af分解对硝基苯基-α-L-阿拉伯呋喃糖苷生成对-硝基苯*，对-硝基苯*在400 nm处有最大吸收峰，通过测定400 nm处吸光值变化可计算得α-L-Af活性。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计、低温离心机、水浴锅/恒温培养箱、1mL玻璃比色皿、超声破碎仪、可调式移液枪、研钵/匀浆器、EP管、冰和蒸馏水。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1、组织：按照组织质量（g）︰提取液体积(mL)为1︰5~10的比例（建议称取约0.1 g组织，加入1 mL提取液）进行冰浴匀浆，然后15000 g，4℃，离心10 min，取上清（若为绿色植物的茎、叶、芽等组织，建议将上清用提取液稀释5倍后检测；若为果肉等组织，上清可直接检测或根据预测定结果稀释相应倍数后检测）置于冰上待测。

2、细胞或细菌：先收集细胞或细菌到离心管内，离心后弃上清；按照细胞或细菌数量（10⁴个）：提取液体积（mL）为500~1000︰1的比例（建议500万个细胞或细菌加入1 mL提取液），冰浴超声波破碎细胞或细菌（功率200 W，超声3秒，间隔7秒，总时间3 min）；然后15000 g，4℃，离心10 min，取上清置于冰上待测。

3、液体：直接检测。

二、测定步骤

1、 分光光度计预热30 min以上，调节波长至400 nm，蒸馏水调零。

2、 将5 µmol/mL的对-硝基苯*标准液用提取液稀释为250、125、62.5、31.25、15.625、7.8125 nmol/mL的标准溶液备用，标准液稀释可参考下表：

备注：实验中每个标准管需300µL标准溶液。

3、 操作表：(在1.5 mL离心管中)

三、α-L-Af活性计算

1、 标准曲线的绘制：

根据标准管的浓度（x，nmol/mL）和吸光度ΔA标准（y，ΔA标准），建立标准曲线。根据标准曲线，将ΔA测定（y，ΔA测定）带入公式计算样本浓度（x，nmol/mL）。

2、 α-L-Af活性的计算：

（1）按蛋白浓度计算

酶活定义：每mg蛋白每小时产生1 nmol对-硝基苯*为1个酶活力单位。

α-L-Af酶活（U/mg prot）= x×V提取÷（V提取×Cpr）÷T=2x÷Cpr

（2）按样本质量计算

酶活定义：每g样本每小时产生1 nmol对-硝基苯*为1个酶活力单位。

α-L-Af酶活（U/g 质量）= x×V提取÷W÷T= 2x÷W

（3）按照细胞或细菌数量计算

酶活定义：每10⁴个细胞每小时产生1 nmol对-硝基苯*为1个酶活力单位。

α-L-Af酶活（U/10⁴ cell）= x×V提取÷细胞数量（万个）÷T= 2x÷细胞数量（万个）

（4）按液体体积计算

酶活定义：每mL样本每小时产生1 nmol对-硝基苯*为1个酶活力单位。

α-L-Af酶活（U/mL）=x×V样÷V样÷T=2x

V提取：提取液体积，1 mL；V样：加入的样本体积，0.3 mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL，蛋白浓度自行测定；W：样本质量，g；T：反应时间，0.5 h。

注意事项：

1、 A或ΔA大于1时，建议将样本用提取液稀释后再进行测定。

2、 正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定，若浓度过高，建议将样本用提取液稀释适当倍数后再进行测定，并在计算公式中乘以稀释倍数；若浓度过低，建议在粗酶液提取时增加组织质量。

3、 加入试剂二后，建议5 min内读取OD值。

实验实例：

1、 取0.1g香蕉进行样本处理，取上清后，按测定步骤操作，测得计算ΔA测定=A测定管-A对照管=0.234-0.105=0.129，带入标准曲线y=0.0037x+0.0029，计算x=34.08，按样本质量计算酶活得：

α-L-Af酶活（U/g 质量）=2x÷W=2×34.08÷0.1=681.6 U/g 质量。

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