肌酐含量检测试剂盒 微量法

肌酐（Cr）含量检测试剂盒说明书（肌氨酸氧化酶法）

微量法

货号：BC4915

规格：100T/96S

产品内容：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

溶液的配制：

1. 试剂一：临用前每支加入1.1 mL蒸馏水，充分溶解。用不完的试剂-20℃分装保存两周。

2. 试剂二：临用前每支加入1.05 mL蒸馏水，充分溶解。用不完的试剂-20℃分装保存两周。

3. 试剂三：临用前每支加入1 mL蒸馏水（100T/96S），充分溶解。为方便储存故多给一支。用不完的试剂-20℃分装保存两周。

4. 试剂三工作液：根据试验所需用量，按照试剂三 : 蒸馏水=1:9的比例，充分混匀，现配现用。

5. 试剂四：临用前加入1 mL蒸馏水，充分溶解。用不完的试剂-20℃分装保存两个月。

6. 试剂五：临用前每支加入2.2 mL蒸馏水，充分溶解。用不完的试剂-20℃分装保存两周。

7. 试剂六：临用前根据实验所需用量，按照试剂六A液：试剂六B液=1:1的比例，充分混匀，现用现配

8. 标准品：1 mg肌酐。临用前加入1 mL蒸馏水，充分溶解，即1 mg/mL标准溶液，2-8℃保存一个月。临用前将其稀释至200μg/mL作为标准液待测。

产品说明：

肌酐（creatinine，Cr），化学式是C₄H₇N₃O，是肌肉在人体内代谢的产物，主要由肾小球滤过排出体外。血中肌酐来自外源性和内源性两种，外源性肌酐是肉类食物在体内代谢后的产物；内源性肌酐是体内肌肉组织代谢的产物。

样品中的肌酐在肌酐酶的催化下水解生成肌酸。在肌酸酶的催化下肌酸水解生成肌氨酸和尿素。肌氨酸在肌氨酸氧化酶的催化下氧化产生过氧化氢。过氧化物酶催化过氧化氢氧化4-氨基安替*林偶联酚，生成有色化合物，在505nm 有特征吸收峰。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计/酶标仪、低温离心机、可调式移液器、微量玻璃比色皿/96孔板、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水、超声破碎仪。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1、 细菌、细胞样本的制备：按照细胞数量（10⁴个）：提取液一体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1 mL提取液一），冰浴超声波破碎细胞（功率300W，超声3秒，间隔9秒，总时间5 min）；于4℃，12000 g离心10 min，取0.8 mL上清液，再加入0.15 mL提取液二，混匀，4℃，12000 g离心10 min后取上清待测。

2、 组织样本的制备：按照质量（g）：提取液一体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1 g组织，加入1mL提取液一）加入提取液一，冰浴匀浆后于4℃，12000 g离心10 min，取0.8 mL上清液，再加入0.15 mL提取液二，混匀，4℃，12000 g离心10 min后取上清待测。

3、 血清（浆）：取100 μL血清（浆）加入1 mL提取液一，4℃，12000 g离心10 min，取0.8 mL上清液，再加入0.15 mL提取液二，4℃，混匀，12000 g离心10 min后取上清待测。

二、测定步骤

1、 分光光度计/酶标仪预热30 min以上，调节波长至505 nm，蒸馏水调零。

2、 按下表步骤加样：

注：空白管只需做1-2次。

三、肌酐含量计算

1、 计算公式

（1）按照蛋白浓度计算

肌酐含量（μg/mg prot）= C标×ΔA测÷ΔA标×V样÷（V样×Cpr）=200×ΔA测÷ΔA标÷Cpr

（2）按照样本质量计算

肌酐含量（μg/g 质量）= C标×ΔA测÷ΔA标×（V上清+V提取液二）÷（W×V上清÷V提取液一）

= 237.5×ΔA测÷ΔA标÷W

（3）按照细菌或细胞数量计算

肌酐含量（μg/10⁴ cell）= C标×ΔA测÷ΔA标×（V上清+V提取液二）÷（细胞数量×V上清÷V提取液一）

= 237.5×ΔA测÷ΔA标÷细胞数量

（4）按照血清（浆）体积计算

肌酐含量（μg/mL）= C标×ΔA测÷ΔA标×(V上清+V提取液二)÷ [V液体×V上清÷(V提取液一+V液体)]

= 2612.5×ΔA测÷ΔA标

C标：标准管浓度，200 μg/mL；V样：加入样本体积，20 μL=0.02mL；V上清：提取时上清液体积，0.8 mL；V提取液一：加入提取液一体积，1 mL；V提取液二：加入提取液二体积，0.15 mL；W：样本质量，g；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；细胞数量：以10⁴计；V液体：液体样本体积，0.1 mL。

注意事项：

1、提取液中含有蛋白沉淀剂，提取的上清液不能用于蛋白浓度的测定。若想要用蛋白浓度计算肌酐含量需要另取样本，即取相同质量的组织、同等数目的细菌或细胞，用1.1875mLPBS（生理盐水）匀浆；取相同体积的血清（浆），用1.206mLPBS（生理盐水）匀浆（相当于提取步骤最终样本上清液），用BCA法进行蛋白浓度测定。

2、如果测定吸光值超过标准管吸光值，建议用蒸馏水稀释样本后再进行测定。如果ΔA测定小于0.01，建议增大样本量后再进行测定。

实验实例：

1、 取0.1g小鼠肌肉加入1mL提取液一进行匀浆研磨离心，取0.8mL上清后加0.15mL提取液二，离心取上清后按照测定步骤操作，用96孔板测定后计算ΔA测=A测定-A空白=0.199-0.054=0.145，ΔA标= A标准-A空白=0.483-0.054= 0.429。按样本质量计算含量得：

肌酐含量（μg/g 质量）=237.5×ΔA测÷ΔA标÷W=802.7μg/g 质量。

2、 取100μL牛血清加入1mL提取液一，取0.8mL上清后加0.15mL提取液二，离心取上清，之后按照测定步骤操作，用96孔板测定后计算ΔA测=A测定-A空白=0.138-0.054=0.084，ΔA标= A标准-A空白=0.483-0.054= 0.429。按照液体体积计算含量得：

肌酐含量（μg/mL）= 2612.5×ΔA测÷ΔA标= 511.5 μg/mL血清。

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