肌酸含量检测试剂盒（酶法） 氮代谢

肌酸含量检测试剂盒（酶法）说明书

可见分光光度法

货号：BC493

规格：50T/24S

产品内容：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

溶液的配制：

试剂一：临用前每支加入1 mL蒸馏水，充分溶解。用不完的试剂分装后-20℃保存。

试剂二：临用前每支加入0.2 mL蒸馏水，充分溶解。用不完的试剂分装后-20℃保存。

试剂三：临用前每支加入0.5 mL蒸馏水（100T/48S），充分溶解。为方便储存故多给一支。用不完的试剂分装后-20℃保存。

试剂四：临用前根据试验所需用量，按照试剂四A液：试剂四B液=1:1，充分混匀，现用现配。

标准品：1 mg一水肌酸。临用前加入1 mL蒸馏水，充分溶解，即1 mg/mL一水肌酸标准储备液。临用前取20μL和80μL蒸馏水混合配制成200μg/mL作为标准溶液待测。现用现配。

产品说明：

肌酸(Creatine)是一种含氮化合物，自然存在于脊椎动物体内，能够辅助为肌肉和神经细胞提供能量。肌酸可由精*酸（arginine)、甘*酸（glycine）及甲硫*酸（methionine）三种氨基酸合成，可由人体自行合成，也可以从食物中摄取。大约95%的肌酸存在于骨骼肌中，主要存在形式为磷酸肌酸。肌酸作为一种补充剂主要通过增加肌肉质量，增强运动表现能力。肌酸也被作为神经肌肉疾病的一种治疗药被广泛研究，它可能有助于保护神经和改善细胞生物功能状态。

肌酸酶偶联肌氨酸氧化酶，可将肌酸转化为甘*酸、甲醛、过氧化氢，过氧化物酶催化过氧化氢氧化4-氨基安*比林偶联酚，生成有色化合物，在505nm 有特征吸收峰。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计、低温离心机、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水、超声破碎仪。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1、细菌、细胞样本的制备：按照细胞数量（10⁴个）: 提取液一体积（mL）为500~1000 : 1的比例（建议500万细胞加入1 mL提取液一），冰浴超声波破碎细胞（功率300W，超声3秒，间隔9秒，总时间5 min）；于4℃，12000 g离心10 min，取0.8 mL上清液，再加入0.15 mL提取液二，4℃，12000 g离心10 min后取上清待测。

2、组织样本的制备：按照质量（g）: 提取液一体积(mL)为1: 5~10的比例（建议称取约0.1 g组织，加入1mL提取液一）加入提取液一，冰浴匀浆后于4℃，12000 g离心10 min，取0.8 mL上清液，再加入0.15 mL提取液二，4℃，12000 g离心10 min后取上清待测。

3、血清（浆）：取100 μL血清（浆）加入1 mL提取液一，4℃，12000 g离心10 min，取0.8 mL上清液，再加入0.15 mL提取液二，4℃，12000 g离心10 min后取上清待测。

二、测定步骤

1、 分光光度计预热30 min以上，调节波长至505 nm，蒸馏水调零。

2、 按下表步骤加样：

注：空白管只需做1-2次。

三、肌酸含量计算

1、 计算公式

（1）按照蛋白浓度计算

肌酸含量（μg/mg prot）=C标×ΔA测÷ΔA标×V样÷（V样×Cpr）×0.879=175.8×ΔA测÷ΔA标÷Cpr

（2）按照样本质量计算

肌酸含量（μg/g 质量）=C标×ΔA测÷ΔA标×（V上清+V提取液二）÷（W×V上清÷V提取液一）×0.879

=208.76×ΔA测÷ΔA标÷W

（3）按照细菌或细胞数量计算

肌酸含量(μg/10⁴ cell) = C标×ΔA测÷ΔA标×(V上清+V提取液二)÷(细胞数量×V上清÷V提取液一)×0.879

= 208.76×ΔA测÷ΔA标÷细胞数量

（4）按照血清（浆）体积计算

肌酸含量(μg/mL) =C标×ΔA测÷ΔA标×(V上清+V提取液二)÷ [V液体×V上清÷(V提取液一+V液体)]×0.879 =2296.39×ΔA测÷ΔA标

C标：标准管浓度，200 μg/mL；V样：加入样本体积，50 μL=0.05mL；V上清：提取时上清液体积，0.8 mL；V提取液一：加入提取液一体积，1 mL；V提取液二：加入提取液二体积，0.15 mL；W：样本质量，g；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；细胞数量：以10⁴计；V液体：液体样本体积，0.1 mL；0.879：换算系数，一水肌酸相对分子质量149.15，无水肌酸相对分子质量131.13，0.879=131.13÷149.15。

注意事项：

1、 显色完成后，请在10 min之内完成检测。

2、 提取液中含有蛋白沉淀剂，提取的上清液不能用于蛋白浓度的测定。若想要用蛋白浓度计算肌酐含量需要另取组织或血清（浆），即取相同质量（体积）的组织（血清（浆））用1.1875mLPBS（生理盐水）匀浆（相当于提取步骤最终样本上清液），用BCA法进行蛋白浓度测定。

3、 如果测定吸光值超过标准管吸光值，建议用蒸馏水稀释样本后再进行测定。如果测定吸光值过小，建议增大样本量后再进行测定。

实验实例：

1、 取0.1g大鼠肌肉加入1mL提取液一进行匀浆研磨离心，取0.8mL上清后加0.15mL提取液二，离心取上清后按照测定步骤操作，测得计算ΔA测定=A测定-A对照=0.752-0.012=0.74，ΔA标准= A标准-A空白=0.672-0.014=0.66。按样本质量计算含量得：肌酸含量（μg/g 质量）=208.76×ΔA ÷ΔA标÷W =2340μg/g 质量。

2、 取100μL牛血清加入1mL提取液一，取0.8mL上清后加0.15mL提取液二，离心取上清，之后按照测定步骤操作，测得计算ΔA测定=A测定-A对照=0.061-0.016=0.045，ΔA标准= A标准-A空白=0.672-0.014=0.66。按照液体体积计算含量得：肌酸含量（μg/mL）=2296.39×ΔA测定÷ΔA标准=156.57 μg/mL血清。

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