硝酸还原酶（NR）活性检测试剂盒 微量法

硝酸还原酶（NR）活性检测试剂盒（Griess显色法）说明书

微量法

货号：BC4965

规格：100T/48S

产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

溶液的配制：

1、 诱导液：将诱导剂储备液用蒸馏水10倍稀释后使用，即取10 mL诱导剂储备液加90 mL蒸馏水，充分混匀。现配现用。

2、 试剂二：加入1mL蒸馏水，-20℃分装保存，可以-20℃保存2周。临用前用蒸馏水将试剂二稀释50倍，备用，即取10 μL试剂二加入490 μL蒸馏水混匀。

3、 标准品：10 μmol/mL亚硝 *准溶液。临用前将用蒸馏水标准溶液稀释100倍得到0.1 μmol/mL的亚硝 *标准液，备用。

产品说明：

NR（EC 1.7.1.3）广泛存在于植物中，是植物硝态氮转化为氨态氮的关键酶，也是诱导酶，对作物的产量和品质有影响。NR催化硝酸盐还原为亚硝酸盐，NO₃^ˉ +NADH+H^＋→NO_2ˉ+NAD^＋+H₂O。在酸性条件下，产生的NO₂^ˉ能够参与重氮化反应生成紫红色化合物，这种紫红色化合物在540 nm处有吸收峰，540 nm下吸光值的变化即可表示酶活。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计/酶标仪、水浴锅、台式离心机、微量玻璃比色皿/96孔板、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1、组织前处理：

（1） 取适量诱导液于烧杯中，将新鲜标本洗净，滤纸吸干，放入诱导液中（淹没即可），避光浸泡2 h，取出样本，滤纸吸干后，-20℃冷冻30 min，取出样本，滤纸吸干。（根据需要进行诱导处理，一般不需要诱导处理，预实验结果没有活性则需要进行诱导处理）

（2） 按照组织质量(g)：提取液体积(mL)为1:5~10的比例(称取约0.1 g样本，加入1 mL提取液)，冰浴研磨，8000g，4℃离心10 min，取上清置冰上待测。

2、细胞或细菌的前处理：

先收集细胞或细菌样本到离心管内，弃上清，按照每500万细胞或细菌加入1mL提取液，超声波破碎细菌或细胞（功率200W，超声3s，间隔10s，重复30次）。8000g，4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

二、测定步骤

1、 可见分光光度计/酶标仪预热30 min以上，调节波长至540 nm，蒸馏水调零。

2、 样本测定：

三、NR活性计算

NR活力计算：

（1）按样本蛋白浓度计算：

酶活定义：每小时每mg组织蛋白催化产生1 μmol NO₂^-的量为1个NR活力单位。

NR活力（U/mg prot）= C标准×（A测定-A对照）÷（A标准-A空白）×V样本÷（V样本×Cpr）÷T×F

= 0.2×（A测定-A对照）÷（A标准-A空白）÷Cpr×F

（2）按样本质量计算：

酶活定义：每小时每g组织催化产生1 μmol NO₂^-的量为1个NR活力单位。

NR活力（U/g 质量）=C标准×（A测定-A对照）÷（A标准-A空白）×V样本÷（W×V样本÷V提取）÷T×F

= 0.2×（A测定-A对照）÷（A标准-A空白）÷W×F

（3）按细胞数量计算：

酶活定义：每小时每1万个细胞或细菌催化产生1 μmol NO₂^-的量为1个NR活力单位。

NR活力（U/10⁴ cell）

=C标准×（A测定-A对照）÷（A标准-A空白）×V样本÷（细胞或细菌数量×V样本÷V提取）÷T×F

= 0.2×（A测定-A对照）÷（A标准-A空白）÷细胞或细菌数量×F

C标准：亚硝 *标准溶液浓度，0.1 μmol/mL；V提取：加入提取液体积，1 mL；W：样本质量，g；T：反应时间，0.5 h；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；V样本：加入的样本体积，0.02 mL；细胞或细菌数量：以万计；F：样本稀释倍数。

注意事项：

1. 吸光度大于1时，建议用提取液稀释样本，注意计算公式中参与计算的稀释倍数要相应改变。

2. 严格按照样本测定表格列出顺序加入试剂进行实验。

实验实例：

1. 取0.1 g绿萝叶片加入1 mL提取液进行匀浆研磨，离心取上清按照测定步骤操作，用96孔板测得A测定=0.078、A对照=0.070、A标准=0.268、A空白=0.046，按样本质量计算酶活得：

NR活力（U/g 质量）= 0.2×（A测定-A对照）÷（A标准-A空白）÷W= 0.0721 U/g 质量。

2. 取0.1 g洋桔梗叶片加入1 mL提取液进行匀浆研磨，离心取上清按照测定步骤操作，用96孔板测得A测定=0.088、A对照=0.064、A标准=0.268、A空白=0.046，按样本质量计算酶活得：

NR活力（U/g 质量）= 0.2×（A测定-A对照）÷（A标准-A空白）÷W= 0.216 U/g 质量。

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