果糖激酶(FRK)活性检测试剂盒 糖代谢

果糖激酶（FRK）活性检测试剂盒说明书

紫外分光光度法

货号：BC5920

规格：50T/48S

产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

溶液的配制：

1. 提取液：临用前将粉剂一溶于提取液中；该试剂为悬浊液，使用前摇匀即可，2-8℃保存12周；

2. 试剂一：试剂放于试剂瓶内玻璃管中。临用前加入6mL蒸馏水，充分溶解，溶解后的试剂-20℃分装保存4周，避免反复冻融；

3. 试剂二：试剂放于试剂瓶内玻璃管中。临用前加入6mL蒸馏水，充分溶解，溶解后的试剂-20℃分装保存4周，避免反复冻融；

4. 试剂三：试剂放于试剂瓶内玻璃瓶中，临用前加入6mL蒸馏水溶解，溶解后的试剂2-8℃分装保存4周；

5. 试剂五工作液：临用前根据样本数量按照试剂五：蒸馏水=8μL: 1000μL（共1008μL，约20T）的比例配制，充分混匀，现配现用；

6. 试剂六：临用前取一支试剂六加入1mL蒸馏水，充分溶解。溶解后的试剂-20℃分装保存2周，避免反复冻融。（该试剂为冻干试剂，可能存在不同瓶间肉眼观察试剂量相差较大甚至量很少的现象，此现象不影响使用，实际质量相同）

产品说明：

果糖激酶（Fructokinase，FRK，EC 2.7.1.4）是催化果糖磷酸化的主要酶。果糖激酶可以作为植物的己糖感受器和信号分子，通过影响植物的生长周期来调控植物的代谢和生长发育进程，果糖磷酸化对于维持淀粉生物合成方向具有重要意义。

FRK催化果糖合成6-磷酸果糖，6-磷酸果糖在磷酸己糖异构酶的作用下异构为6-磷酸葡萄糖，6-磷酸葡萄糖脱氢酶进一步催化6-磷酸葡萄糖脱氢生成NADH，NADH在340nm有特征吸收峰。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。

需自备的仪器和用品：

紫外分光光度计、低温离心机、分析天平、水浴锅/恒温培养箱、1mL石英比色皿、可调式移液枪、研钵/匀浆

器/细胞超声破碎仪、冰和蒸馏水。

操作步骤：

一、 样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1. 组织样本：按样本质量（g）: 提取液体积（mL）=1 : 5~10比例加入提取液（建议称取0.1g样本，加入1.0mL提取液），冰浴匀浆后，于4℃，8000g，离心10min，弃沉淀，取上清液置于冰上待测。

2. 细胞样本：按细胞数量（10⁶）：提取液体积（mL）=5~10 : 1的比例加入提取液（建议5百万细胞加入1.0mL提取液），冰浴超声破碎细胞（功率200W，超声3s，间隔7s，总时间3min），然后于4℃，8000g，离心10min，弃沉淀，取上清液置于冰上待测。

3. 液体样本：直接测定。若液体有浑浊则离心取上清测定。

二、 测定步骤

1．紫外分光光度计预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。

2．试剂四37℃预热15min。

3．在1mL石英比色皿按下表顺序加样：

三、FRK活性计算

1. 按样本蛋白浓度计算

单位的定义：在37℃温度下每mg组织蛋白每分钟催化产生1nmol的NADH定义为一个酶活单位。

FRK活性（U/mg prot）=ΔA÷(ε×d)×V反总×10⁹÷(Cpr×V样) ÷T=321.54×ΔA÷Cpr

2. 按样本质量计算

单位的定义：在37℃温度下每g组织每分钟催化产生1 nmol的NADH定义为一个酶活单位。

FRK活性（U/g 质量）=ΔA÷(ε×d)×V反总×10⁹÷(W÷V提取×V样) ÷T =321.54×ΔA÷W

3. 按细胞数目计算

单位的定义：在37℃温度下每10⁶个细胞每分钟催化产生1 nmol的NADH定义为一个酶活单位。

FRK活性（U/10⁶ cell）=ΔA÷(ε×d)×V反总×10⁹÷(N÷V提取×V样) ÷T =321.54×ΔA÷N

4. 按液体体积计算

单位的定义：在37℃温度下每毫升每分钟催化产生1 nmol的NADH定义为一个酶活单位。

FRK活性（U/mL）=ΔA÷(ε×d)×V反总×10⁹÷V样÷T =321.54×ΔA

ε：NADH摩尔消光系数，6.22×10³ L / mol /cm；d：1mL石英比色皿光径，1cm；V反总：反应总体积，1×10^-3L；10⁹：单位换算，1mol=10⁹nmol；V样：加入样本体积，0.1mL；V提取：提取液体积，1mL； Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；W：样本质量，g；N：细胞数目，以10⁶计；T：反应时间，5min。

注意事项：

1. 如果∆A小于0.005，可以增加样本量或延长反应时间再进行测定；如果∆A测定大于0.6或A1测定小于A1空白，建议将样本稀释或者缩短反应时间再进行测定。注意同步修改计算公式。

实验实例：

1. 取0.1023g土豆组织样本，加入提取液进行冰浴匀浆，离心后取上清，按照测定步骤操作，用1mL石英比色皿测得计算：ΔA测定=A2测定-A1测定=0.165-0.092=0.073，ΔA空白=A2空白-A1空白=0.013-0.012=0.001，ΔA=ΔA测定- ΔA空白=0.072。按样本质量计算得：

FRK活性（U/g 质量）=321.54×ΔA÷W = 226.304 U/g 质量。

2. 取0.06g酵母粉，加入提取液进行冰浴匀浆，离心后取上清，按照测定步骤操作，用1mL石英比色皿测得计算：ΔA测定=A2测定-A1测定=0.737-0.237=0.5，ΔA空白=A2空白-A1空白=0.013-0.012=0.001，ΔA=ΔA测定- ΔA空白=0.499。按样本质量计算得：

FRK活性（U/g 质量）=321.54×ΔA÷W =2674.141 U/g 质量。

参考文献：

[1] Giroix M H, Jijakli H, Courtois P, et al. Fructokinase activity in rat liver, ileum, parotid gland, pancreas, pancreatic islet, B and non-B islet cell homogenates.[J].International Journal of Molecular Medicine, 2006, 17(3):517-522.

[2] Kurt, Bergbauer, Ralf, et al. Studies on Fructose Metabolism in Cultured Astroglial Cells and Control Hepatocytes: Lack of Fructokinase Activity and Imrrunoreactivity in Astrocytes[J].Developmental Neuroscience, 2009, 18(5-6):371-379.

[3] Schaffer A A, Petreikov M. Inhibition of fructokinase and sucrose synthase by cytosolic levels of fructose in young tomato fruit undergoing transient starch synthesis[J].Physiologia Plantarum, 2010, 101(4):800-806.

相关系列产品：

BC0740/BC0745  己糖激酶（HK）活性检测试剂盒

BC0530/BC0535  磷酸果糖激酶（PFK）活性检测试剂盒

BC2190/BC2195  磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）活性检测试剂盒

BC2450/BC2455  植物组织果糖（FT）含量检测试剂盒

果糖激酶(FRK)活性检测试剂盒 糖代谢 果糖激酶(FRK)活性检测试剂盒 糖代谢