果胶酶活性检测试剂盒 糖代谢

果胶酶活性检测试剂盒说明书

可见分光光度法

注意：本产品试剂有所变动，请注意并严格按照该说明书操作。

货号：BC2630

规格：50T/24S

产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

溶液的配制：

1、 试剂一：将试剂一A倒入试剂一B于50℃水浴中溶解（期间可拿出振荡数次）。该试剂易长菌，配制完成后可-20℃分装保存，可保存12周。

2、 标准品：10mg半乳糖醛酸。临用前加入0.943mL蒸馏水，配成50μmol/mL的标准液。

产品说明：

果胶酶（pectinase）是分解果胶的酶类，包括原果胶酶，果胶酯酶，多聚半乳糖醛酸酶和果胶裂解酶四大类，广泛存在于高等植物果实和微生物中，是水果加工中最重要的酶。

果胶酶水解果胶生成半乳糖醛酸，半乳糖醛酸与DNS试剂反应生成在540nm有特征吸收峰的棕红色物质，测定540nm处吸光值变化可计算得果胶酶活性。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、1mL玻璃比色皿、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1、组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液）进行冰浴匀浆，然后10000g，4℃，离心10min，取上清置于冰上待测。

2、菌类：按照细菌数量（10⁴个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌加入1mL提取液），冰浴超声波破碎细菌（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后10000g，4℃，离心10min，取上清置于冰上待测。

3、液体：直接检测。

二、测定步骤

1、 可见分光光度计预热30min 以上，调节波长至540nm，蒸馏水调零。

2、 将50μmol/mL 标准液用蒸馏水稀释为6、5、4、3、2、1 μmol/mL的标准溶液备用。

3、 取125μL样本沸水浴10min备用。

4、 样本测定（在1.5mL离心管中）：

三、果胶酶活性计算

1、 标准曲线的绘制：

以各个标准溶液的浓度为x轴，其对应的ΔA标准为y轴，绘制标准曲线，得到标准方程y=kx+b，将ΔA带入方程得到x（μmol/mL）。

2、 果胶酶活性的计算：

（1）按蛋白浓度计算

酶活定义：在50℃，pH3.5条件下，每毫克蛋白每小时分解果胶产生1μmol半乳糖醛酸为1个酶活力单位。

果胶酶活性（U/mg prot）=x×V提取÷（V提取×Cpr）÷T= 2x÷Cpr

（2）按样本质量计算

酶活定义：在50℃，pH3.5条件下，每克样本每小时分解果胶产生1μmol半乳糖醛酸为1个酶活力单位。

果胶酶活性（U/g 质量）= x×V提取÷W÷T=2x÷W

（3）按照细菌数量计算

酶活定义：在50℃，pH3.5条件下，每10⁴个细菌每小时分解果胶产生1μmol半乳糖醛酸为1个酶活力单位。

果胶酶活性（U/10⁴ cell）= x×V提取÷T÷细菌数量（万个）=2x÷细菌数量（万个）

（4）按液体体积计算

酶活定义：在50℃，pH3.5条件下，每mL样本每小时分解果胶产生1μmol半乳糖醛酸为1个酶活力单位。

果胶酶活性（U/mL）= x×V样÷V样÷T= 2x

V提取：提取液体积，1mL； V样：加入的样本体积，0.125mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；W：样本质量，g；T：反应时间：0.5h。

注意事项：

1、 A大于1.5时，建议将样本用提取液稀释后再进行测定。

2、 植物果实组织建议将样本稀释10倍或20倍后再测定。

实验实例：

1. 0.1g猕猴桃加入1mL提取液进行冰浴匀浆，然后10000g，4℃，离心10min，取上清置于冰上稀释10倍后按照测定步骤操作，测得计算ΔA= A测定管-A对照管=1.465-1.45=0.015，依据标准曲线y=0.2575x-0.2214，计

算得x=0.918μmol/mL，按样本质量计算酶活得：

果胶酶活性（U/g质量）=2x÷W×10（稀释倍数）= 183.6 U/g质量。

相关发表文献：

[1] Yuxing Wu,Liangsheng Xu,Zhiyuan Yin,et al. Transcription factor VmSeb1 is required for the growth, development, and virulence in Valsa mali. Microbial Pathogenesis. October 2018;132-138.(IF2.581)

[2] Yuxing Wu,Liangsheng Xu,Zhiyuan Yin,et al. Two members of the velvet family,VmVeA and VmVelB,affect conidiation,virulence and pectinase expression in Valsa mali. Molecular Plant Pathology. November 2017;(IF4.379)

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