亚硝酸还原酶(NiR)检测试剂盒 微量法

亚硝酸还原酶（NiR）活性检测试剂盒说明书

微量法

注意：本产品试剂有所变动，请注意并严格按照该说明书操作。

货号：BC1545

规格：100T/48S

产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

溶液的配制：

1、 试剂二：每瓶临用前加入2.5mL蒸馏水充分溶解，2-8℃保存2周；

2、 试剂三：临用前加入5mL蒸馏水，可70-80℃加热溶解；2-8℃可以保存3个月；

3、 试剂五：若出现沉淀，可70-80℃加热溶解；

4、 标准品：10µmol/mL亚硝*标准溶液；

5、 工作液：临用前根据样本量将试剂四和试剂五按1:1的比例混合，现用现配。

产品说明：

亚硝酸还原酶（Nitrite reductase，NiR）是亚硝态氮还原过程中的关键酶，在自然界氮素循环过程中发挥着重要作用，其广泛存在于微生物及植物体内，能够催化亚硝酸盐还原，减少亚硝态氮在环境中的积累，降低其对生物体生长发育的毒害作用。

亚硝酸还原酶可将NO₂^-还原为NO，使样本中参与重氮化反应生成紫红色化合物的NO₂^-减少，即540nm处吸光值的变化可反应样本中亚硝酸还原酶的活性。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计/酶标仪、低温离心机、水浴锅、可调式移液器、微量玻璃比色皿/96孔板、天平、研钵/匀浆器/细胞超声破碎仪、冰和蒸馏水。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1. 组织：按样本质量（g）: 提取液体积（mL）1 : 5~10比例（建议称取0.1g样本，加入1.0mL提取液）加入提取液，冰浴匀浆后，于4 ℃，10000g，离心10min，弃沉淀，取上清液置于冰上待测。

2. 细菌或细胞：按细胞数量（10⁴）：提取液体积（mL）500~1000 : 1的比例（建议500万细胞加入1.0mL提取液）加入提取液，冰浴超声破碎细胞（功率200w，超声3s，间隔7s，总时间3min），然后于4℃，10000g，离心10min，弃沉淀，取上清液置于冰上待测。

二、测定步骤

1、 分光光度计/酶标仪预热30min 以上，调节波长至540nm，分光光度计蒸馏水调零。

2、 标准液的稀释：将10µmol/mL的标准溶液用蒸馏水稀释至0.2、0.1、0.05、0.025、0.0125、0.00625、0.003125 µmol/mL标准溶液待测。

3、 标准液稀释可参考下表：

备注：下述实验中每个标准管需70µL标准液（注意不要在此步骤直接检测吸光值）。

4、 样本测定：

三、亚硝酸还原酶活性计算

1. 标准曲线的绘制

以标准溶液浓度为x轴（x，μmol/mL），标准溶液对应的ΔA标准为y轴（y，ΔA标准），建立标准曲线，得到标准方程y=kx+b，将ΔA测定带入方程得到x（μmol/mL）。

2. 酶活计算

（1）按照蛋白浓度计算

酶活单位定义：每mg组织蛋白每小时还原1μmol NO₂^ˉ的量为一个酶活力单位。

NiR（U/mg prot）=x×V1÷V2×V提÷（Cpr×V提）÷T=x×7÷Cpr

（2）按照样本质量计算

酶活单位定义：每g组织每小时还原1μmol NO₂^ˉ的量为一个酶活力单位。

NiR（U/g 质量）=x×V1÷V2×V提÷W÷T=x×7÷W

（3）按照细菌/细胞数量计算

酶活单位定义：每10⁴个细菌/细胞每小时还原1μmol NO₂^ˉ的量为一个酶活力单位。

NiR（U/10⁴ cell）=x×V1÷V2×V提÷细菌/细胞数量÷T=x×7÷细菌/细胞数量

V1：取上清液前的反应体系体积，0.14mL；V2：加入的样本体积，0.02mL；V提：加入的提取液体积，1.0mL；T：反应时间，1h；W：土样质量，g；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；细菌/细胞数量：以10⁴计。

实验实例：

1、 取0.1g杨树叶片加入1mL提取液进行匀浆研磨，按照测定步骤操作，用96孔板测得计算ΔA测定= A基质管-（A测定管-A对照管）=0.863-（0.705-0.065）=0.223，带入标准曲线y=8.4313x+0.003，R²⁼0.9999，计算x=0.0261，按样本质量计算酶活得：

NiR（U/g 质量）=x×7÷W=0.0261×7÷0.1=1.827 U/g 质量。

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