辅酶Ⅰ NAD(H)含量检测试剂盒 微量法

辅酶 I NAD (H)含量检测试剂盒（WST显色法）说明书 

微量法

货号：BC5195

规格：100T/48S

产品内容：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

溶液的配制：

1、 NAD标准品：临用前加入 1.5 mL 蒸馏水，即 2 µmol/mL。-20℃可以保存2周。

2、 NADH标准品：临用前加入 1.4 mL 蒸馏水，即 2 µmol/mL。-20℃可以保存2周。

产品说明：

辅酶I包括还原型和氧化型两种形式，在生物氧化中起传递氢的作用。氧化型辅酶I又称烟*胺腺嘌呤二核苷酸（NAD⁺）是脱氢酶的辅酶，它在糖酵解、糖异生、三羧酸循环和呼吸链中发挥着不可替代的作用。中间产物会将脱下的氢递给NAD，使之成为NADH（还原型辅酶I）。而NADH则会作为氢的载体，在呼吸链中通过化学渗透偶联的方式，合成 ATP。NAD(H)在机体内有重要的生理意义，与物质代谢、能量代谢、抗细胞衰老、抗氧化以及一些疾病的发生密切相关。体内辅酶I含量降低会导致细胞损伤或衰亡。

分别用酸性和碱性提取液提取样本中NAD⁺和NADH，在1-mPMS作用下，WST-1可与NADH 反应，产生水溶性formazan，在450nm下有特征吸收峰，而NAD⁺可被乙醇脱氢酶还原为NADH，进一步采用WST-1检测。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计/酶标仪、低温离心机、水浴锅，研钵/匀浆器、超声破碎仪、可调式移液器、微量玻璃比色皿/96孔板、冰和蒸馏水。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1、血清（浆）中NAD⁺和NADH的提取：

NAD⁺的提取：建议取0.1mL血清（血浆），加入0.5mL酸性提取液，煮沸5min（盖紧，以防止水分散失）；冰浴冷却后，10000g， 4℃离心10min；取200μL上清液，加入200μL碱性提取液使之中和；混匀，10000g 4℃离心 10min，取上清，冰上待测。

NADH的提取：建议取0.1mL血清（血浆），加入0.5 mL碱性提取液，煮沸5min（盖紧，以防止水分散失）；冰浴冷却后，10000g， 4℃离心10min；取200μL上清液，加入200μL酸性提取液使之中和；混匀，10000g 4℃离心 10min，取上清，冰上待测。

2、组织中NAD⁺和NADH的提取：

NAD⁺的提取：建议取0.1g组织质量，加入0.5mL酸性提取液，冰浴研磨，煮沸5min（盖紧，以防止水分散失）；冰浴冷却后，10000g， 4℃离心10min；取200μL上清液，加入200μL碱性提取液使之中和；混匀，10000g 4℃离心 10min，取上清，冰上待测。

NADH的提取：建议取0.1 g组织质量，加入0.5 mL碱性提取液，冰浴研磨，煮沸5min（盖紧，以防止水分散失）；冰浴冷却后，10000g， 4℃离心10min；取200μL上清液，加入200μL酸性提取液使之中和；混匀，10000g 4℃离心 10min，取上清，冰上待测。

3、细胞或细菌中 NAD 和 NADH 的提取：

NAD⁺的提取：先收集细胞或细菌到离心管内，离心弃上清，建议500万细胞或者细菌加入0.5mL酸性提取液，超声波破碎（冰浴，功率200W，超声3s，停10s，重复30次），煮沸5min（盖紧，以防止水分散失）；冰浴冷却后，10000g， 4℃离心10min；取200μL上清液，加入200μL碱性提取液使之中和；混匀，10000g 4℃离心 10min，取上清，冰上待测。

NADH的提取：建议500万细胞或者细菌加入0.5mL碱性提取液，超声波破碎（冰浴，功率200W，超声3s，停10s，重复30次），煮沸 5min（盖紧，以防止水分散失）；冰浴冷却后，10000g， 4℃离心10min；取200μL上清液，加入200μL酸性提取液使之中和；混匀，10000g 4℃离心 10min，取上清，冰上待测。

二、测定步骤

1、 分光光度计/酶标仪预热30 min以上，调节波长至450 nm，分光光度计蒸馏水调零。

2、 NAD⁺标准品：用蒸馏水稀释为1.25、0.625、0.3125、0.15625、0.078、0.039、0.0195、0nmol/mL的标准溶液，0nmol/mL即空白管。

3、 NADH标准品：用蒸馏水稀释为10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125、0.15625、0.078、0nmol/mL的标准溶液，0nmol/mL即空白管。

4、 稀释表（附于说明书最后）

5、 在EP管中按顺序加入下列试剂：

 混匀， 450nm下比色，读取吸光值，NAD⁺的记为：ΔA_NAD= A₂- A₁，NADH的记为ΔA_NADH= A₂’- A₁’，NAD标准管的记为ΔA _NAD标= A_标-A空白管。NADH标准管的记为ΔA _NADH标= A_标’-A空白管。（标准曲线只需做1-2次，每个测定管需设一个对照管）

三、NAD⁺和NADH含量计算

1、标准曲线绘制：

（1） NAD⁺标准曲线的绘制：

根据标准管的浓度（x₁，nmol/mL）和吸光度ΔA标准（y₁，ΔA标准），建立标准曲线。根据标准曲线，将ΔA测定代入方程得到x₁（nmol/mL）。

（2） NADH标准曲线的绘制

根据标准管的浓度（x₂，nmol/mL）和吸光度ΔA标准（y₂，ΔA标准），建立标准曲线。根据标准曲线，将ΔA´代入方程得到x₂（nmol/mL）。

2、NAD⁺和NADH含量计算

（一）NAD⁺含量计算

（1） 按液体体积计算：NAD⁺含量(nmol/mL）= x₁×（V提取+V血清）÷V血清=11×x₁

（2） 按样本蛋白浓度计算 NAD⁺ (nmol/mg prot）= x₁×V提取÷(V提取×Cpr)= x₁ ÷ Cpr

（3） 按样本鲜重计算NAD⁺含量(nmol/g 质量）= x₁×V提取÷W= x₁÷W 

（4） 按细胞数量计算：NAD⁺含量(nmol/10⁴ cell）= x₁×V提取÷500=0.002×x₁

（二）NADH含量计算

（1） 按液体体积计算：NADH含量(nmol/mL）= x₂×（V提取+V血清）÷V血清=11×x₂

（2） 按样本蛋白浓度计算 NADH (nmol/mg prot）= x₂×V提取÷(V提取×Cpr)= x₂ ÷ Cpr

（3） 按样本鲜重计算NADH含量(nmol/g 质量）= x₂×V提取÷W= x₂÷W 

（4） 按细胞数量计算：NADH含量(nmol/10⁴ cell）= x₂×V提取÷500=0.002×x₂

V提取：加入提取液体积，1mL；V血清：血清（浆）体积，0.1mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500万。

注意事项：

1、反应过程中注意避光。

2、如果测定吸光值超过线性范围吸光值，可以增加样本量或者稀释样本后再进行测定。同步修改计算公式。

实验实例：

1. NAD⁺的测定：称取约 0.1g 冬青叶片，按提取步骤提取后按照测定步骤操作，玻璃比色皿测得吸光值后计算 ΔA 测定=A测定-A对照=0.119-0.106=0.013，标准曲线y₁=0.373x+0.0012,根据标曲得出x₁=0.032，NAD⁺含量得：NAD⁺ (nmol/g 质量）= x₁÷W=0.32 nmol/g 质量。

NADH的测定：称取约 0.1g 冬青叶片，按提取步骤提取后按照测定步骤操作，玻璃比色皿测得吸光值后计算 ΔA 测定=A测定-A对照=0.172-0.128=0.044，标准曲线y₂=0.1479x,根据标曲得出x₂=0.297，NADH含量得：NADH (nmol/g 质量）= x₂÷W=2.97 nmol/g 质量。

2. NAD⁺的测定：称取约 0.1g 小鼠肝脏，按提取步骤提取后按照测定步骤操作，玻璃比色皿测得吸光值后计算 ΔA 测定=A测定-A对照=0.119-0.105=0.014，标准曲线y₁=0.373x+0.0012,根据标曲得出x₁=0.034，NAD⁺含量得：NAD⁺ (nmol/g 质量）= x₁÷W=3.4nmol/g 质量。

NADH的测定：称取约 0.1g 小鼠肝脏，按提取步骤提取后按照测定步骤操作，玻璃比色皿测得吸光值后计算 ΔA 测定=A测定-A对照=0.145-0.112=0.033，标准曲线y₂=0.1479x,根据标曲得出x₂=0.223，NADH含量得：NADH (nmol/g 质量）= x₂÷W=2.23 nmol/g 质量。

3. NAD⁺的测定：取0.1mL马血清，按提取步骤提取后按照测定步骤操作，玻璃比色皿测得吸光值后计算 ΔA 测定=A测定-A对照=0.114-0.097=0.017，标准曲线y₁=0.373x+0.0012,根据标曲得出x₁=0.042，NAD⁺含量得：NAD⁺ (nmol/g 质量）= x₁÷W=0.42 nmol/g 质量。

NADH的测定：取0.1mL马血清，按提取步骤提取后按照测定步骤操作，玻璃比色皿测得吸光值后计算 ΔA 测定=A测定-A对照=0.142-0.135=0.007，标准曲线y₂=0.1479x，根据标曲得出x₂=0.047，NADH含量得：NADH (nmol/g 质量）= x₂÷W=0.47 nmol/g 质量。

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