锰过氧化物酶（Mnp）活性检测试剂盒 微量法

锰过氧化物酶（Mnp）活性检测试剂盒说明书

微量法

注意：本产品试剂有所变动，请注意并严格按照该说明书操作。

货号：BC1625

规格：100T/96S

产品内容：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

溶液配制：

试剂四：临用前根据实验所需量按照试剂四（μL）：蒸馏水（μL）=1:49的比例配制，现用现配。

产品说明：

锰过氧化物酶（Mnp）（EC1.11.1.13）是一种普遍存在于细菌和真菌中的微生物木质素分解酶，在微生物木质素分解系统中起着关键作用，它可以有效的降解木质素以及废水和土壤中比较难降解的化合物，在生物制浆、生物漂白和污染物的生物降解等工业领域具有广泛应用。

锰过氧化物酶在Mn²⁺环境下，可将愈创木酚氧化为四邻甲氧基连酚，四邻甲氧基连酚在465nm处有吸收峰，通过检测465nm处吸光值的变化，可测定锰过氧化物酶的活性。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计/酶标仪、低温离心机、水浴锅/恒温培养箱、超声波细胞破碎仪、可调式移液器、研钵/匀浆器、微量玻璃比色皿/96孔板、震荡仪、冰和蒸馏水。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1、 组织：按照样本质量（g）：试剂一体积（mL）为1:5~10 的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL试剂一）加入试剂一，冰浴匀浆；10000g 4℃离心10min，取上清置冰上待测。

2、 细菌或细胞样本：收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清，按照细菌或细胞数量（10⁴个）：试剂一体积（mL）为 500-1000:1 的比例（建议500万细菌或细胞加入 1mL 试剂一）加入试剂一，超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率30%或300W，超声 3s，间隔 7s，总时间3min），10000g 4℃离心10min，取上清置冰上待测。

3、液体样本：直接检测。若溶液浑浊则离心后取上清进行测定。

二、测定步骤

1、可见分光光度计/酶标仪预热30min以上，调节波长至465nm，可见分光光度计需用蒸馏水调零。

2、测定前根据实验用量取出部分试剂一、试剂二、试剂三和试剂四置于37℃（哺乳动物）或25℃（其他动物）预热10min以上。

3、加样表（在微量玻璃比色皿/96孔板中依次加入下列试剂)：

    将上述试剂分别加入微量玻璃比色皿/96孔板后迅速吹打混匀，记录第30s的吸光值A1以及10min30s时的吸光值A2，计算ΔA =A2-A1。若一次性测定样本过多，可根据使用量将试剂一、二、三、四按5:1:2:1比例配成工作液后进行预热，测定时按照20μL样本+180μL工作液加入微量玻璃比色皿/96孔板进行测定。

三、Mnp活力的计算

A．用微量石英比色皿测定的计算公式如下：

1.按样本蛋白质浓度计算

酶活定义：pH4.5条件下，每mg组织蛋白每分钟氧化1nmol愈创木酚所需的酶量为一个酶活单位。

Mnp活性（U/mg prot）= ΔA×V反总÷(ɛ×d)×10⁹÷(V样×Cpr)÷T= 82.64×ΔA÷Cpr

2.按样本质量计算

酶活定义：pH4.5条件下，每mg组织每分钟氧化1nmol愈创木酚所需的酶量为一个酶活单位。

Mnp活性（U/g 质量）= ΔA×V反总÷(ɛ×d)×10⁹÷(V样÷V样总×W)÷T= 82.64×ΔA÷W

3.按细菌/细胞数量计算

酶活定义：pH4.5条件下，每10⁴细菌/细胞每分钟氧化1nmol愈创木酚所需的酶量为一个酶活单位。

Mnp活性（U/10⁴ cell）= ΔA×V反总÷(ɛ×d)×10⁹÷(V样÷V样总×细胞数量)÷T= 82.64×ΔA÷细胞数量

4.按照样本体积计算

酶活定义：pH4.5条件下，每mL血清或液体样本每分钟消耗1nmol 底物的酶量为一个酶活单位。

Mnp 活性（U/mL）=ΔA×V反总÷(ɛ×d)×10⁹÷V样÷T= 82.64×ΔA

ε：愈创木酚摩尔消光系数：12100L/mol/cm；d:比色皿光径，1cm；V反总：反应总体积，0.0002L；V样：加入样本体积，0.02mL，V样总：提取液体积，1mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；T：反应时间，10 min；10⁹：单位换算系数，1mol=10⁹nmol。

B．用96孔UV板测定的计算公式如下：

1.按样本蛋白质浓度计算

酶活定义：pH4.5条件下，每mg组织蛋白每分钟氧化1nmol愈创木酚所需的酶量为一个酶活单位。

Mnp活性（U/mg prot）= ΔA×V反总÷(ɛ×d)×10⁹÷(V样×Cpr)÷T=137.74×ΔA÷Cpr

2.按样本质量计算

酶活定义：pH4.5条件下，每g组织每分钟氧化1nmol愈创木酚所需的酶量为一个酶活单位。

Mnp活性（U/g 质量）= ΔA×V反总÷(ɛ×d)×10⁹÷(V样÷V样总×W)÷T=137.74×ΔA÷W

3. 按细菌/细胞数量计算

酶活定义：pH4.5条件下，每10⁴细菌/细胞每分钟氧化1nmol愈创木酚所需的酶量为一个酶活单位。

Mnp活性（U/10⁴ cell）= ΔA×V反总÷(ɛ×d)×10⁹÷(V样÷V样总×细胞数量)÷T=137.74×ΔA÷细胞数量

4．按照样本体积计算

酶活定义：pH4.5条件下，每mL血清或液体样本每分钟消耗1nmol 底物的酶量为一个酶活单位。

Mnp 活性（U/mL）=ΔA×V反总÷(ɛ×d)×10⁹÷V样÷T= 137.74×ΔA

ε：愈创木酚摩尔消光系数：12100 L/mol/cm；d:比色皿光径，0.6cm；V反总：反应总体积，0.0002L；V样：加入样本体积，0.02mL，V样总：提取液体积，1mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；T：反应时间，10 min；10⁹：单位换算系数，1mol=10⁹nmol。

注意事项：

当A1大于1.5或者ΔA大于0.6（酶标仪ΔA大于0.4）时，建议将样本用试剂一稀释后测定；当ΔA过小时，可以适当加大样本量后重新进行测定。注意同步修改计算公式。

实验实例：

取0.1002g杏鲍菇加入1mL试剂一进行冰浴匀浆。10000g 4℃离心10min，取上清置冰上，之后按照测定步骤操作，测得计算A1=0.055，A2=0.064，ΔA=A2-A1=0.009，按样本质量计算酶活得：

Mnp 活性（U/g 质量）=ΔA×V反总÷(ɛ×d)×10⁹÷V样÷T=12.37U/g 质量。

参考文献：

[1] Chowdhary P, Shukla G, Raj G, et al. Microbial manganese peroxidase: a ligninolytic enzyme and its ample opportunities in research[J]. SN Applied Sciences, 2019, 1(1):45.

[2] Rogalski J, Lundell T, Leonowicz A, et al. Production of laccase, lignin peroxidase and manganese-dependent peroxidase by various strains of Trametes versicolor depending on culture conditions[J]. Polish Society of Microbiologists, 1991, 40(3-4):221-234.

相关系列产品：

BC1630/BC1635  漆酶活性检测试剂盒

BC0200/BC0205  过氧化氢酶（CAT）活性检测试剂盒

BC0090/BC0095  过氧化物酶（POD）活性检测试剂盒

BC1610/BC1615  木质素过氧化物酶（Lip）活性检测试剂盒

锰过氧化物酶（Mnp）活性检测试剂盒 微量法 锰过氧化物酶（Mnp）活性检测试剂盒 微量法