β-1,3葡聚糖酶活性检测 糖代谢

β-1,3葡聚糖酶（β-1,3-GA）活性检测试剂盒说明书
可见分光光度法
注意：本产品试剂有所变动，请注意并严格按照该说明书操作。
货号：BC0360
规格：50T/24S
产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

溶液的配制：
试剂一：临用前取1支加1.6 mL蒸馏水溶解，用不完的试剂2-8℃保存 4周；
标准品：10 mg无水*糖。临用前加入1 mL蒸馏水溶解，配制成10 mg/mL葡萄糖溶液备用，2-8℃保存2周。
产品说明：
β-1,3-GA( EC 3.2.1.39)主要存在植物中，催化β-1,3-葡萄糖苷键水解。在植物染病或处于其他逆境条件下，可诱导细胞大量合成β-1,3-GA，因此β-1,3-GA活性测定广泛应用于植物病理和逆境生理研究。
β-1,3-GA水解昆布多糖，内切β-1,3-葡萄糖苷键，产生还原末端，通过测定还原糖生成速率，来计算其酶活性。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
可见分光光度计、台式离心机、水浴锅/恒温培养箱、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵/匀浆器、超声破碎仪、冰和蒸馏水。
操作步骤：
一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1. 组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。12000g，4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

2. 细菌或细胞：收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照每500万细菌或细胞加入1mL提取液，超声波破碎细菌或细胞（功率200w超声3s，间隔10s，重复30次）；12000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

二、测定步骤

1. 分光光度计预热30min 以上，调节波长至540nm，蒸馏水调零。

2. 标准品的准备：将标准品用蒸馏水稀释至1、0.8、0.6、0.4、0.2mg/mL。

3. 标准品稀释表

实验中每个标准管需100µL标准溶液。

1. 样本测定（在1.5mL EP 管中依次加入下列试剂）

充分混匀，沸水浴5min（盖紧，防止水分散失），流水冷却，540nm 处记录各管吸光值A，ΔA=A 测定-A对照。每个测定管需设一个对照管。标准曲线和空白管只需做1-2次。
如果吸光值大于2，可以用提取液对样本稀释后测定（计算公式乘以相应稀释倍数）。
三、β-1,3-GA活性计算
1、标准曲线的建立：
根据标准管吸光度x（A标准管-A空白管）和浓度（y，mg/mL）建立标准曲线，将ΔA带入公式中计算出样本中产生的还原糖的含量y值（mg/mL）。
2、β-1,3-GA活性计算：

1. 按蛋白浓度计算

单位的定义：每mg组织蛋白每小时产生1mg还原糖定义为一个酶活性单位。
β-1,3-GA活性 (U/mg prot)=(y×V1)÷(V1×Cpr)÷T=y÷Cpr

1. 按样本质量计算

单位的定义：每g组织每小时产生1mg还原糖定义为一个酶活性单位。
β-1,3-GA 活性(U/g 质量)=(y×V1)÷(W×V1÷V2)÷T=y÷W

1. 按细菌或细胞数量计算

单位的定义：每1万个细胞或细菌每小时产生1mg还原糖定义为一个酶活性单位。
β-1,3-GA 活性(U/10⁴ cell)=( y×V1)÷(500×V1÷V2)÷T=0.002×y
V1：加入反应体系中样本体积，0.1mL；V2：加入提取液体积，1mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；T：反应时间，60min=1h；500：细菌或细胞总数，万。

相关发表文献：

1. X Niu,Q Xu,W Wang,et al. The antifungal activity of a thaumatin-like protein from oyster Crassostrea gigas.

Invertebrate Survival Journal. June 2018;(IF0.967)
参考文献：

1. Mohammadi M, Karr A L. Beta-1, 3-glucanase and chitinase activities in soybean root nodules[J]. Journal of plant physiology, 2002, 159(3): 245.

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