品牌 | SOLARBIO/索莱宝 | 货号 | SEKM0002 |
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规格 | 48T/96T | 供货周期 | 现货 |
主要用途 | 小鼠白细胞介素-1β含量测定 | 应用领域 | 生物产业 |
小鼠白细胞介素-1βELISA试剂盒
背景介绍:
IL-1分为IL-1a, IL-1β两种,人和小鼠IL-1基因定位于2号染色体,均含7个外显子。IL-1前体(ProIL-1)为31kDa,通过蛋白水解酶裂解形成成熟的IL-1分子。IL-1在不同种属中有较高同源性。在氨基酸水平上,IL-1α和IL-1β在不同种属同源性分别为60%~70%和75%~78%; IL-1α和IL-1β分子量约17.5kDa, 等电点分别为5和7,同源性为28% 。 17kDa的成熟小鼠IL-1β与棉鼠和大鼠的IL-1β具有90%的氨基酸序列同一性,与犬、马、猫、人、猪和猴的IL-1β具有65%-78%的同一性。
IL-1β主要由血液中的单核细胞和巨噬细胞产生 , 星形细胞,少突神经胶质细胞,肾上腺皮质细胞,NK细胞,内皮细胞,角质形成细胞,巨核细胞,血小板,神经元,中性粒细胞,成骨细胞,许旺细胞,滋养层细胞,T细胞和成纤维细胞也可产生IL-1β 。IL-1具有广泛的免疫调节作用,并有致热和介导炎症的作用。
检测原理:
Solarbio (Solarbio ®)ELISA试剂盒采用基于双抗体夹心法的酶联免疫吸附检测技术。将抗小鼠IL-1β单克隆抗体包被在酶标板上;分别加入梯度稀释的标准品和预稀释的样本,标准品和样本中的小鼠IL-1β会与酶标板上的包被抗体充分结合;洗板后加入生物素化抗小鼠IL-1β抗体,该抗体会与板子上包被抗体捕获的标准品和样本中的小鼠IL-1β发生特异性结合;洗板后加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的链霉亲和素,生物素与链霉亲和素会发生高强度的非共价结合;洗板后加入显色剂底物TMB,若反应孔中样品存在不同浓度的小鼠IL-1β,则HRP会使无色TMB变成不同深浅(正相关)的蓝色物质,加入终止液后反应孔会变成黄色;后,在λmax=450 nm(OD=450 nm)处测定反应孔样品吸光度(OD),样本中的小鼠IL-1β浓度与OD成正比,通过绘制标准曲线和四参数拟合软件便可计算出样本中小鼠IL-1β的浓度。
原理图:
注意事项:※※※
盖上,使用前请离心处理(5-10 S即可),使管壁上的液体集中在管底部,取用时,请用移液器小心吹打几次。
安全提示:试剂盒中的终止液为酸性溶液,操作人员在使用时请带上手套并注意防护;在操作过程中也要避免试剂接触皮肤和眼睛,如果不慎接触,请用大量清水清洗;检测血液样本及其它体液样本时,请按国家生物实验室安全防护有关管理规定执行。
试剂盒组成及储存:
试剂盒组成 | 规格(96T) | 规格(48T) | 保存条件 |
抗体预包被酶标板
| 8*12 | 8*6 | 2-8℃ |
标准品 | 2支 | 1支 | -20 ℃ |
标准品/样本稀释液(SR1) | 16 ml/瓶 | 8 ml/瓶 | 2-8℃ |
浓缩生物素化抗体 | 120 ul(100X) | 60 ul(100X) | 2-8℃ |
抗体稀释液(SR2) | 16 ml/瓶 | 8 ml/瓶 | 2-8℃ |
浓缩酶结合物(避光) | 120 ul(100X) | 60 ul(100X) | 2-8℃ |
酶结合物稀释液(SR3) | 16 ml/瓶 | 8 ml/瓶 | 2-8℃ |
浓缩洗涤液 (20×) | 30 ml/瓶 | 15 ml/瓶 | 2-8℃ |
显色底物(避光) | 12 ml/瓶 | 6 ml/瓶 | 2-8℃ |
终止液 | 12 ml/瓶 | 6 ml/瓶 | 2-8℃ |
封板胶纸 | 4张 | 2张 |
|
说明书 | 1份 | 1份 |
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自备实验器材(不提供,可代购)
样本收集及储存:
将细胞培养基移无菌离心管,在4℃条件下1000×g离心10 min,然后将上清等量分装于小EP管并于-20℃下保存(24小时内检测可放入2-8℃储存),避免反复冻融。
室温血液自然凝固20 min后,在4℃条件下1000×g离心10 min,然后将上清等量分装于小EP管并于-20℃下保存(24小时内检测可放入2-8℃储存),保存过程中如有沉淀,请再次离心,避免反复冻融。
将全血收集到含抗血凝剂的管中,根据标本的实际要求选择EDTA,柠檬酸钠或肝素作为抗凝剂,混合20 min,在4℃条件下1000×g离心10 min,然后将上清等量分装于小EP管并于-20℃下保存(24小时内检测可放入2-8℃储存),避免反复冻融。
※注意:血清血浆样本避免使用溶血、高血脂样本,以免影响检测结果;如果样本中的靶标物检测浓度高于标准品的高值,请将样品做适当倍数稀释后检测,建议正式实验前做预实验以确定稀释倍数。
试剂准备:
3. 标准品梯度稀释:加入标准品/样本稀释液(SR1)1ml冻干标准品中,静置15分钟待其*溶解后轻轻混匀(浓度为2000pg/ml),然后按照以下浓度:2000、1000、 500、 250、125、62.5、31.25、 0 pg/ml进行稀释。复溶过的标准品原液(2000pg/ml)未用完的应废弃或根据需要按照一次用量分装,并将其贮存在-20~-80℃冰箱,具体如下图。
4. 生物素化抗体工作液:预先计算好试验所需用量,用检测稀释液(SR2)将100倍抗体浓缩液稀释成1倍应用工作液(稀释前充分混匀),请在30分钟内加入到反应孔中。
生物素化抗体工作液具体稀释方法如下:
板条 | 浓缩生物素化抗体(1:100):μL | 检测稀释液(SR2):μL |
2 | 20 | 1980 |
4 | 40 | 3960 |
6 | 60 | 5940 |
8 | 80 | 7920 |
10 | 100 | 9900 |
12 | 120 | 11880 |
5. 酶结合物工作液:按每次试验所需用量配制,用酶结合物稀释液(SR3)将100倍浓缩酶结合物稀释成1倍应用工作液(稀释前离心),请在30分钟内使用。
酶结合物工作液具体稀释方法如下:
板条 | 浓缩酶结合物(1:100):μL | 检测稀释液(SR3):μL |
2 | 20 | 1980 |
4 | 40 | 3960 |
6 | 60 | 5940 |
8 | 80 | 7920 |
10 | 100 | 9900 |
12 | 120 | 11880 |
6. 洗涤方法:
检测步骤:
结果判断:
1.用酶标仪 450 nm 波长测定 OD 值。选择双波长检测,参考波长为 630 nm。如不能进行双波长检测,请用 450 nm 的OD测定值减去630 nm的OD测定值。
2.计算标准品、样品的平均OD值:每个标准品和标本的OD值应减去零孔的OD值
3.以标准品浓度为横坐标,吸光度OD值为纵坐标,用软件绘制标准曲线,样品中IL-1β含量可通过对应OD值由标准曲线换算出相应的浓度。
4.若标本OD值高于标准曲线上限,应做适当稀释后重新检测,计算浓度时再乘以稀释倍数。
参数表征:
1. 数据及标准曲线
标准品浓度(pg/ml) | OD值1 | OD值2 | 平均值 | 矫正值 |
0 | 0.066 | 0.051 | 0.0585 | ---- |
31.25 | 0.135 | 0.131 | 0.133 | 0.074 |
62.5 | 0.22 | 0.256 | 0.238 | 0.179 |
125 | 0.37 | 0.312 | 0.341 | 0.282 |
250 | 0.656 | 0.625 | 0.640 | 0.582 |
500 | 1.212 | 1.265 | 1.238 | 1.180 |
1000 | 2.112 | 2.098 | 2.105 | 2.046 |
2000 | 3.014 | 2.965 | 2.989 | 2.931 |
本图仅供参考,应以当次试验标准品绘制的标准曲线计算小鼠IL-1β的样本含量
2. 灵敏度:
低可检测小鼠IL-1β浓度达15pg/ml,
20个零标准品浓度OD的平均值加上两个标准差,计算相应的可检测浓度。
3. 特异性:
不与小鼠IL-2、3、4、6、7、10、IL-1a、IL-1Ra等反应
4. 重复性:
板内,板间变异系数<10%
5. 回收率:
在选取的健康小鼠血浆、细胞培养上清中加入 3 个不同浓度水平的小鼠 IL-1β,计算回收率。
样本类型 | 平均回收率(%) | 范围(%) |
血浆 | 97 | 81-101 |
细胞培养上清 | 102 | 90-105 |
6. 线性稀释:
分别在选取的4 份健康小鼠血浆和细胞培养上清中加入高浓度小鼠 IL-1β,在标准曲线动力学范围内进行稀释,评估线性。
稀释比例 | 回收率(%) | 血浆 | 细胞培养上清 |
1:2 | 平均回收率(% ) | 95 | 102 |
范围(%) | 90-103 | 95-113 | |
1:4 | 平均回收率(% ) | 102 | 93 |
范围(%) | 86-112 | 86-101 | |
1:8 | 平均回收率(% ) | 92 | 103 |
范围(%) | 87-113 | 95-114 | |
1:16 | 平均回收率(% ) | 103 | 97 |
范围(%) | 92-112 | 87-111 |
参考文献:
1. Dinarello, C.A. (1994) Eur. Cytokine Netw. 5:517.
2. March, C.J. et al. (1985) Nature 315:641.
3. Sims, J.E. et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8946.
4. Sims, J.E. et al. (1988) Science 241:585.
5. Huang, J. et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:12829.
6. Wesche, H. et al. (1997) J. Biol. Chem. 272:7727.
7. Sims, J.E. et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6155.
8. Giri, J.G. et al. (1994) J. Immunol. 153:5802.
9. Symons, J.A. et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:1714.
10. Wewers, M.D. et al. (1997) J. Immunol. 159:5964.
11. Gonzales-Hernandez, J.A. et al. (1995) Clin. Exp. Immunol. 99:137.
常见问题及解决方法:
问题 | 可能原因 | 解决方法 |
高背景或阴性对照值偏高 | 洗板不充分 | 将洗涤液注入反应孔充分洗涤,*拍干孔中液体 |
酶结合物过量 | 检查酶稀释度,按说明书标识的稀释度稀释 | |
底物污染 | 加底物前检查底物是否为透明无色,请勿用变蓝的底物,重新用新的底物试验 | |
阴性对照孔被阳性对照污染 | 注意洗涤时不要把洗液溢出孔外,不使阴阳对照孔液体涟接一起 | |
不同批次试剂混用 | 检查试剂批号,请勿用不同批次试剂 | |
显色信号弱 | 试剂过期 | 检查试剂盒有效期,请勿用过期试剂 |
孵育时间过短 | 按说明书中规定的时间孵育 | |
试剂污染 | 检查试剂是否污染,请勿用污染的试剂 | |
酶标仪滤光片不匹配 | 检查酶标仪设置及滤光片是否匹配 | |
试剂盒平衡不充分 | 确保试剂盒试验前平衡室温 | |
显色时间不够 | 增加底物显色时间 | |
无显色信号 | 检测抗体、酶、或显色剂漏加 | 检查试验操作流程,重复试验 |
酶被叠氮钠污染 | 请使用重新配制的试剂 | |
试剂添加顺序有误 | 检查复核试验添加顺序、流程,重复试验 | |
标曲佳但样品孔无信号 | 样品中靶标物含量低或样品中无靶标物 | 设置阳性对照,重复实验 |
样品基质效应影响检测 | 重新稀释样品后复测 | |
标曲佳但样品信号偏高 | 样品中待检物含量超过标准曲线范围 | 重新稀释样品后复测 |
边缘效应 | 孵育温度不均衡 | 孵育时每步均使用新的封板胶纸,避免在环境温度变化大的地方孵育,勿叠放反应板 |
小鼠白细胞介素-1βELISA试剂盒订购说明:
1、绝大部分产品备有现货,一般情况下都能订货当日发货。
2、部分非常用产品,需提前1-2日预订,海外期货则需要提前3-6周预订。
3、部分产品价格会因货期、批次等因素发生变化,若有变动以订货当日新价格为准。
4、每日订单截止时间为16点整,部分城市可到17点整,因超过截止时间造成当日不能发货的将于次日安排发货。
5、请办理完货款后,将底单等连同收货人的地址、姓名、等以传真、、短信、等形式通知我们。
运输说明:
极低温产品:极低温产品运输过程中加装干冰运输。用干冰把产品包裹起来,再用泡沫盒密封,胶带层层粘住泡沫盒,放入索莱宝的箱子,然后交付给合作快递,安全快速高效放心的送客户的手中,保证产品的性质稳定如一,为您的实验保驾护航。
低温产品:低温产品运输过程中加装索莱宝冰袋运输。事先用冰袋把产品包裹起来,再使用泡沫盒密封,用胶带严实密封泡沫盒,再放入索莱宝的箱子(保温效果少可以持续一周),然后交付给合作快递,安全快速高效放心的送客户的手中,保证产品的性质稳定如一,为您的实验保驾护航。
常温产品:常温产品运输过程中无需加冰或者特殊包装。产品由公司库房人员快速配货,准确快速高效的快递保证产品快速送达您的手中。