嘌呤霉素筛选细胞的原理

嘌呤霉素(puromycin;PM ) 是一种蛋白质合成抑制剂,它具有与tRNA分子末端类似的结构，能够同氨基酸结合，代替氨酰化的tRNA同核糖体的A位点结合，并掺入到生长的肽链中。用嘌呤霉素筛选细胞方法如下：
嘌呤霉素筛选细胞
转染（24孔板进行）或电转后培养24小时，按10%密度传代（传36mm平皿），继续培养24小时，待细胞密度增20%-25%回合时；
去掉培养液，PBS洗一次，加入按照佳嘌呤霉素筛选细胞的浓度（杀伤曲线试验确定）配制好的嘌呤霉素筛选细胞培养基2-3ml。
根据培养基的颜色和细胞的存活情况，每隔2天更换一次嘌呤霉素筛选细胞用培养基（培养基用量为2-4ml，细胞多，多家培养基，细胞少，少加培养基），一般在3-1天内出现细胞大量或少量死亡情况（如果转染效率或电转效率高，则死亡少；如果转染率或电转率低，则死亡多；如果筛选浓度偏低，嘌呤霉素筛选细胞培养基用量少，细胞密度大于80%，会导致大量假阳性克隆）。如果少选*周，出现细胞大量死亡，则在原培养皿中继续加入嘌呤霉素筛选细胞培养基筛选一周；如果删选*周，出现细胞少量死亡，则把细胞按照10%密度传代（传35mm平皿，传一个皿即可，多余细胞丢弃），利用少选培养基进行筛选一周；
筛选第二周结束后，则把细胞消化下来。进行重点稀释（10ul培养基中含1个细胞，用筛选培养基），把上述10ul细胞悬液假日96孔板中（提前加入40ul筛选培养基），伊红加入24孔，4小时候观察每个孔的情况。记录只含一个细胞的孔，含有一个细胞的孔用于继续筛选，其余孔舍弃；
根据培养基的颜色和细胞生长情况换入新的嘌呤霉素筛选细胞用培养基待细胞密度为80%时，将其传代24孔板中增殖，待细胞密度为80%时，将其传代6孔板中增殖，待细胞密度为80%时，将其传代T25瓶（一传3）中增殖，每隔3天换液。
细胞大量扩增后，一瓶用于提取中RNA进行QPCR检测，一瓶用于总蛋白进行WB检测，另一瓶用于保种，根据QPCR和WB结果取舍阳性克隆。
嘌呤霉素筛选细胞方法如上，具体的嘌呤霉素筛选细胞让发如上，嘌呤霉素稳定性高，可以常温运输，收到产品后4℃存放；
嘌呤霉素在室温条件下可存放3个月，4℃条件下保质期一年。为了达到理想的稳定状态和长的保质期，好存放于-20°C，保质期为2年。