6-磷酸葡萄糖含量检测试剂盒 糖酵解

动物组织6-磷酸葡萄糖（G6P）含量检测试剂盒说明书

紫外分光光度法

货号：BC5960

规格：50T/48S

产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

溶液的配制：

1、 试剂一：临用前将试剂一A全部溶于试剂一B，充分溶解后使用，未用完的试剂2-8℃保存4周（试剂颜色由透明至淡黄色为正常现象，可正常使用），禁止放-20℃保存。

2、 试剂二：临用前加入1mL蒸馏水充分溶解，未用完的试剂-20℃分装保存4周，避免反复冻融。

3、 试剂三：临用前加入1mL蒸馏水充分溶解，未用完的试剂-20℃分装保存4周，避免反复冻融（该试剂为冻干试剂，可能存在肉眼观察不同瓶内试剂量相差较大甚至量很少的现象，此现象不影响使用，实际质量相同）。

4、 试剂三工作液：临用前根据样本量按试剂三：蒸馏水=10μL：40μL（共50μL，约4T）的比例配制后使用，现配现用。

5、 标准品：临用前加入1.645mL蒸馏水充分溶解成20μmol/mL 6-磷酸葡萄糖标准品，2-8℃保存4周。

6、 0.5μmol/mL标准品配制：取25μL 20μmol/mL 6-磷酸葡萄糖标准品，加975μL蒸馏水充分溶解成0.5μmol/mL 标准品进行测定，现配现用。

7、 工作液：临用前根据样本量按试剂一：试剂二：试剂三工作液=1.45mL：25μL：25μL（共1.5mL，约2T）配成工作液后使用，现配现用。

产品说明：

6-磷酸葡萄糖（Glucose-6- Phosphate，G6P），又称葡萄糖-6-磷酸，是糖酵解和磷酸戊糖途径的中间产物，广泛存在于动植物体和微生物中。在糖酵解的第一步反应中，葡萄糖被己糖激酶催化生成葡萄糖-6-磷酸，然后通过磷酸葡萄糖异构酶的催化形成果糖-6-磷酸，以继续糖酵解的其它步骤；而在戊糖磷酸途径中，葡萄糖-6-磷酸是其第一个底物，该过程也是生成NADPH的主要途径。此外，葡萄糖-6-磷酸也能转化形成糖原或淀粉而被储存起来。

6-磷酸葡萄糖脱氢酶可催化G-6-P和NADP⁺生成6-磷酸葡萄糖酸和NADPH，在340nm处有吸收峰，据此可以计算6-磷酸葡萄糖的含量。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。

需自备的仪器和用品：

紫外分光光度计、1mL石英比色皿、天平、低温离心机、水浴锅/恒温培养箱、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

组织：按照质量（g）：提取液体积（mL）为1：5~10的比例（建议称取约0.1g，加入1mL提取液）加入取液，冰浴匀浆后于沸水浴煮5min（用封口膜封口，防止爆盖），冷却至室温后于4℃ 12000g离心10min，取上清置冰上待测。

二、测定步骤

1、 紫外分光光度计预热30min以上，调节波长至340nm，用蒸馏水调零。

2、 工作液37℃预热5min。

3、 样本测定（在1mL石英比色皿中加入下列试剂）

三、6-磷酸葡萄糖含量计算公式

1. 按样本蛋白浓度计算：

G6P含量（μmol/g prot）=ΔA测定÷（ΔA标准÷C标准）×V提取÷（Cpr×V提取）×F

=0.5×ΔA测定÷ΔA标准÷Cpr×F

2. 按样本质量计算：

G6P含量（μmol/g 质量）=ΔA测定÷（ΔA标准÷C标准）×V提取÷W×F

=0.5×ΔA测定÷ΔA标准÷W×F

C标准：标准点浓度，0.5μmol/mL；V提取：加入提取液的体积，1mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；W：样本质量，g；F：稀释倍数。

注意事项：

1. 最好两个人同时做此实验，一个人比色，一个人计时，以保证实验结果的准确性。

2. 若样本ΔA测定<0.01，可适当增大样本量后测定；若样本ΔA测定>1.2或A测定>1.5，可用蒸馏水稀释上清液后测定，注意同步修改计算公式中的稀释倍数。

实验实例：

1、 取0.102g大鼠肝脏加入提取液进行冰浴匀浆，取上清后按照测定步骤操作，用1mL石英比色皿测得ΔA测定=（A2测定-A1测定）-（A2空白-A1空白）=（0.285-0.175）-（0.005-0.005）=0.110，ΔA标准=（A2标准-A1标准）-（A2空白-A1空白）=（0.492-0.023）-（0.005-0.005）=0.469，按样本质量计算6-磷酸葡萄糖含量得：

G6P含量（μmol/g 质量）=0.5×ΔA测定÷ΔA标准÷W×F =1.150 μmol/g质量。

2、 取0.103g大鼠肺加入提取液进行冰浴匀浆，取上清后按照测定步骤操作，用1mL石英比色皿测得ΔA测定=（A2测定-A1测定）-（A2空白-A1空白）=（0.199-0.127）-（0.005-0.005）=0.072，ΔA标准=（A2标准-A1标准）-（A2空白-A1空白）=（0.492-0.023）-（0.005-0.005）=0.469，按样本质量计算6-磷酸葡萄糖含量得：

G6P含量（μmol/g 质量）=0.5×ΔA测定÷ΔA标准÷W×F =0.745 μmol/g 质量。

参考文献：

[1] Belford J, Feinleib M R .The increase in glucose-6-phosphate content of the heart after the administration of inotropic catecholamines, calcium, and aminophylline[J].Biochemical Pharmacology, 1962, 11(11):987-994.

[2] Ashcroft S , Capito K , Hedeskov C .Time course studies of glucose-induced changes in glucose-6-phosphate and fructose-1, 6-diphosphate content of mouse and rat pancreatic islets[J].Diabetologia, 1973, 9(4):299-302.

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