品牌 | SOLARBIO/索莱宝 | CAS | 详询 |
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分子式 | 详询 | 纯度 | 详询 |
分子量 | 详询 | 货号 | BC3310 |
规格 | 50T/48S | 供货周期 | 现货 |
主要用途 | 丙酮酸羧激酶(PEPCK)检测 | 应用领域 | 环保,化工,生物产业,农业,综合 |
磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)活性检测试剂盒说明书
紫外分光光度法
货号:BC3310
规格:50T/48S
产品组成:使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致,有疑问请及时联系索莱宝工作人员。
试剂名称 | 规格 | 保存条件 |
提取液 | 液体60 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
试剂一 | 液体45 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
试剂二 | 粉剂×1瓶 | -20℃保存 |
试剂三 | 液体45 μL×1支 | 2-8℃保存 |
试剂四 | 液体155 μL×1支 | 2-8℃保存 |
试剂五 | 粉剂×1瓶 | -20℃保存 |
溶液的配制:
1、 试剂二:临用前加入35 mL试剂一溶解。可溶解后分装-20℃保存,避免反复冻融。
2、 试剂三:液体置于试剂瓶内EP管内。临用前加入蒸馏水按体积比1:120稀释,现用现配。
3、 试剂四:液体置于试剂瓶内EP管内。临用前加入蒸馏水按体积比7:250稀释,现用现配。
4、 试剂五:粉剂置于试剂瓶内玻璃管内。临用前加入2.5 mL蒸馏水充分溶解;可溶解后分装-20℃保存,避免反复冻融。
5、 工作液的配制:将试剂二、试剂三、试剂四按7:1:1(V:V:V)的比例配制工作液,工作液现用现配。
产品说明:
PEPCK(EC 4.1.1.32)广泛存在于动物、开花植物、藻类、部分真菌和细菌中。该酶催化草酰乙酸转化为磷酸烯醇式丙酮酸,是调节糖异生途径的第一限速酶。
PEPCK催化草酰乙酸生成磷酸烯醇式丙酮酸和CO2,丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶进一步依次催化NADH氧化生成NAD+,在340nm下测定NADH下降速率,即可反映PEPCK活性。
注意:实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品:
紫外分光光度计、低温离心机、水浴锅、1mL石英比色皿、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。
操作步骤:
一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)
组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL提取液)进行冰浴匀浆,然后8000g,4℃,离心10min,取上清,置冰上待测。
细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(104个):提取液体积(mL)为500~1000:1的比例(建议500万细菌或细胞加入1mL提取液),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率20%或200W,超声3s,间隔10s,重复30次);8000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。
血清(浆)样本:直接检测。
二、测定步骤
1、 紫外分光光度计预热30min以上,调节波长至340nm,蒸馏水调零。
2、 将工作液置于37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)预热5分钟。
3、 操作表:在1mL石英比色皿中依次加入下列试剂:
试剂名称 | 空白管 | 测定管 |
样本(µL) | 50 | |
蒸馏水(µL) | 50 | |
工作液(µL) | 900 | 900 |
试剂五(µL) | 50 | 50 |
加入试剂五后立即混匀,于340nm处测定初始吸光值A1和1min时的吸光值A2,计算ΔA测定管= A1测定-A2测定,ΔA空白管=A1空白-A2空白,ΔA=ΔA测定管-ΔA空白管(空白管只需做1-2次)。 |
三、PEPCK酶活计算
1、 按蛋白浓度计算
酶活定义:每mg组织蛋白每分钟消耗1 nmol 的NADH定义为一个酶活力单位。
PEPCK酶活(U/mg prot)= ΔA÷(ε×d)×109×V反总÷(V样×Cpr)÷T= 3215.4×ΔA÷Cpr
2、 按样本质量计算
酶活定义:每g组织每分钟消耗1 nmol 的NADH定义为一个酶活力单位。
PEPCK酶活(U/g 质量)= ΔA÷(ε×d)×109×V反总÷(V样×W÷V样总)÷T=3215.4×ΔA÷W
3、 按细菌或细胞数量计算
酶活定义:每104个细菌或细胞每分钟消耗1 nmol 的NADH定义为一个酶活力单位。
PEPCK酶活(U/104 cell)= ΔA÷(ε×d)×109×V反总÷(500×V样÷V样总)÷T= 6.43×ΔA
4、 按血清(浆)体积计算
酶活定义:每毫升血清(浆)每分钟消耗1 nmol 的NADH定义为一个酶活力单位。
PEPCK(U/mL)=ΔA÷(ε×d)×109×V反总÷V样÷T=3215.4×ΔA
ε:NADH摩尔消光系数,6.22×103 L/mol/cm;d:比色皿光径,1cm;V反总:反应体系总体积,0.001L;V样:反应体系中样本体积,0.05mL;V样总:加入提取液体积,1mL;Cpr:样本蛋白浓度,mg/mL,蛋白浓度自行测定;W:样本质量,g,T:反应时间:1min;500:细菌或细胞总数,500万;109:单位换算系数,1mol=109nmol。
注意事项:
1、 当A1小于1或ΔA大于0.6时,建议将样本稀释适当倍数后再进行测定,以提高检测灵敏度。
2、 酶活性高的样本如动物肝、肾等组织,建议将样本用提取液稀释5倍或5倍以上测定。
3、 空白管为检测各试剂组分质量的检测孔,正常情况下,变化不超过0.06。
4、 加样、混匀等步骤要迅速,秒表计时要准确,如果条件允许建议由两人配合完成本测定试验。
实验实例:
1、 取0.1g肾脏加入1mL提取液进行匀浆研磨,取上清后再用提取液稀释10倍,之后按照测定步骤操作,测得计算ΔA测定管= A1测定-A2测定=1.175-0.532=0.643,ΔA空白管=A1空白-A2空白=1.29-1.244=0.046,ΔA=ΔA测定管-ΔA空白管=0.643-0.046=0.597,按样本质量计算酶活得:
PEPCK酶活(U/g质量)= 3215.4×△A÷W×10(稀释倍数)=3215.4×0.597÷0.1×10=191959.4 U/g 质量。
2、 取0.1g芦荟加入1mL提取液进行匀浆研磨,取上清后按照测定步骤操作,测得计算ΔA测定管= A1测定-A2测定=1.257-1.106=0.151,ΔA空白管= A1空白-A2空白=1.29-1.244=0.046,ΔA=ΔA测定管-ΔA空白管=0.151-0.046=0.105,按样本质量计算酶活得:
PEPCK酶活(U/g质量)= 3215.4×ΔA÷W=3215.4×0.105÷0.1=3376.17 U/g 质量。
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