品牌 | SOLARBIO/索莱宝 | CAS | 详询 |
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分子式 | 详询 | 纯度 | 详询 |
分子量 | 详询 | 货号 | BC3335 |
规格 | 100T/96S | 供货周期 | 现货 |
主要用途 | 测定原理: GCS催化UDPG和葡萄糖残基生成糖原和UTP,丙酮酸激酶和乳酸脱 | 应用领域 | 环保,化工,生物产业,农业,综合 |
糖原合成酶(GCS)活性检测试剂盒说明书
微量法
注意:本产品试剂有所变动,请注意并严格按照该说明书操作。
货号:BC3335
规格:100T/96S
产品组成:使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致,有疑问请及时联系索莱宝工作人员。
试剂名称 | 规格 | 保存条件 |
提取液 | 液体110 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
试剂一 | 液体25 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
试剂二 | 液体7.5 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
试剂三 | 液体20 μL×1支 | 2-8℃保存 |
试剂四 | -20℃保存 | |
试剂五 | 粉剂×2支 | |
试剂六 | 液体45 μL×1支 | 2-8℃保存 |
试剂七 | 粉剂×2支 | -20℃保存 |
试剂八 | 粉剂×2瓶 | 2-8℃保存 |
溶液的配制:
1、 试剂四:用前取1支加入1.5 mL试剂一充分溶解,-20℃分装保存4周,避免反复冻融;
2、 试剂五:用前取1支加入1.5 mL试剂一充分溶解,-20℃分装保存4周,避免反复冻融;
3、 工作液的配制:临用前将试剂三离心,取10 μL试剂三,加7 mL试剂一、1.5 mL试剂四、1.5.mL试剂五,充分混合(约66T),现用现配,也可根据样本量按比例配制;
4、 试剂八的配制:
(1) 临用前取1瓶试剂八加入2.5 mL试剂二溶解,再加入1支试剂七溶解,可-20℃分装保存4周,避免反复冻融;
(2) 用前试剂六先离心,取14 μL试剂六加入1.46mL上述(1)中溶液,充分混合(约36T),现用现配,也可根据样本量按比例配制。
产品说明:
糖原合成酶(Glycogen synthase , GCS)将UDPG的糖基加到原有糖原或是糖原蛋白的非还原端,以α-1,4糖苷键连接。GCS是动物机体糖原合成过程的限速酶,同时也是胰岛素作用的主要靶酶,在糖代谢及维持血糖相对稳定的过程中有着重要作用。
GCS催化UDPG和葡萄糖残基生成糖原和UDP,丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶进一步依次催化NADH生成NAD+,在340 nm下测定NADH的下降速率,即可反映GCS活性。
注意:实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品:
紫外分光光度计/酶标仪、低温台式离心机、水浴锅、超声破碎仪、微量石英比色皿/96孔UV板、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。
操作步骤:
一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)
组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL提取液)进行冰浴匀浆,然后,8000g,4℃离心10min,取上清置于冰上待测。
细菌或细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细胞数量(104个):提取液体积(mL)为500~1000:1的比例(建议500万细胞加入1mL提取液),冰浴超声波破碎细胞(功率200w,超声3秒,间隔7秒,总时间3min);然后8000g,4℃,离心10min,取上清置于冰上待测。
血清等液体:直接检测。(若溶液浑浊则离心后取上清进行测定)
二、测定步骤
1、 紫外分光光度计/酶标仪预热30min以上,调节波长至340nm,紫外分光光度计蒸馏水调零。
2、 临用前将工作液与试剂八置于37℃水浴锅中预热5min(工作液用多少预热多少)。
3、 操作表:在微量石英比色皿/96孔UV板中分别加入下列试剂:
试剂名称(µL) | 空白管 | 测定管 |
样本 | - | 10 |
蒸馏水 | 10 | - |
试剂八 | 40 | 40 |
工作液 | 150 | 150 |
加入样本即开始计时,充分混匀后于340nm处测定10s时的吸光值A1和1min 10s时的吸光值A2,计算ΔA测定管= A1测定-A2测定,ΔA空白管=A1空白-A2空白,ΔA=ΔA测定管-ΔA空白管(空白管只需做1-2次)。 |
三、GCS酶活计算
A、按微量石英比色皿计算:
1. 按蛋白浓度计算
酶活定义:每毫克蛋白每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
GCS酶活(U/mg prot)=ΔA÷(ε×d)×V反总×109÷(V样×Cpr)÷T=3215.4×ΔA÷Cpr
2. 按样本质量计算
酶活定义:每克样本每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
GCS酶活(U/g 质量)=ΔA÷(ε×d)×V反总×109÷(V样×W÷V样总)÷T =3215.4×ΔA÷W
3. 按照细菌或细胞数量计算
酶活定义:每104个细胞每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
GCS酶活(U/104 cell)=ΔA÷(ε×d)×V反总×109÷(V样÷V样总×细胞数量(万个))÷T
=3215.4×ΔA÷细胞数量(万个)
4. 按液体体积计算
酶活定义:每毫升液体每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
GCS酶活(U/mL)=ΔA÷(ε×d)×V反总×109÷V样÷T =3215.4×ΔA
ε:NADH摩尔消光系数,6.22×103 L/mol/cm;d:比色皿光径,1cm;109:单位换算系数,1mol=109nmol;V
反总:反应体系总体积,2×10-4L;V样:反应体系中样本体积,0.01mL;Cpr:样本蛋白浓度,mg/mL;W:样本质量,g;V样总:加入提取液体积,1mL;T:反应时间:1min。
B、按96孔UV板计算:
将上述公式中的d-1cm改为d-0.6cm(96孔UV板光径)进行计算即可。
实验实例:
1、 取0.1g小鼠心脏加入1mL提取液进行样本处理,取上清后按照测定步骤操作,用微量石英比色皿测得计算ΔA测定管=A1测定-A2测定=1.2455-1.1883=0.0572,ΔA空白管=A1空白-A2空白=0.9639-0.9529=0.011,ΔA=ΔA测定管-ΔA空白管=0.0572-0.011=0.0462,按照样本质量计算酶活得:
GCS酶活(U/g 质量)=3215.4×ΔA÷W=1485.5 U/g 质量。
注意事项:
1、 样本提取上清液置于冰上待测,提取样本建议当天测完。
2、 若ΔA大于0.2,建议将样本用提取液稀释适当倍数后测定,以提高检测灵敏度,并在计算公式中乘以相应的稀释倍数。
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