丙酮酸羧化酶（PC）检测试剂盒 糖异生系列

丙tong酸羧化酶（PC）活性检测试剂盒说明书
紫外分光光度法
注意：本产品试剂有所变动，请注意并严格按照该说明书操作。
货号: BC0730
规格: 50T/48S
产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

溶液的配制：

1. 试剂三：临用前加入5 mL蒸馏水溶解；可分装后-20℃保存2周，避免反复冻融；

2. 试剂四：临用前加入5 mL蒸馏水溶解；可分装后-20℃保存2周，避免反复冻融；

3. 试剂六：临用前加入0.2mL试剂六稀释液溶解，可分装后-20℃保存4周，避免反复冻融； 

4. 试剂六工作液：临用前根据样本量按试剂六：试剂六稀释液=0.05mL：1.5mL（共1.55mL，约15T）的比例进行配制，现用现配，当天用完；

5. 工作液的配制：按照试剂二：试剂三：试剂四=2:1:1的体积比例充分混匀，现用现配。

产品说明：

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
紫外分光光度计、低温离心机、水浴锅、1mL石英比色皿、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。
操作步骤：“具体操作步骤详见“产品资料"附件"

注意事项：

1. 为保证实验结果的准确性，需先取1-2个样做预实验，ΔA大于0.8时，建议将粗酶液用提取液稀释后再进行测定。当ΔA小于0.01时，可以延长反应时间（5min或10min）来测定。

2. 空白管为检测各试剂组分质量的检测孔，正常情况下，变化不超过0.05。

3. 样本的蛋白浓度需自行测定，由于提取液中含有较高的蛋白浓度（约1mg/mL），所以测定样本蛋白浓度时需扣除提取液自身蛋白浓度。

4. 推荐使用样本蛋白浓度计算酶活，若用样本质量计算，则需加测胞浆提取物酶活，上清和沉淀酶活之和方为总酶活。

5. 本试剂盒试剂足够完成50管反应。

6、附:使用样本重量计算公式：（样本检测数为50T/24S）
A、上清中PC活力的计算:
酶活定义：每克样本每分钟消耗1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
PC酶活（U/g质量）=ΔA1÷（ε×d）×10⁹×V反总÷（V样×W÷V样总）÷T = 1607×ΔA1÷W
ΔA1：上清测定值；ε：NADH摩尔消光系数，6.22×10³ L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V反总：反应体系总体积，1×10^-3L；V样：反应体系中样本体积，0.05mL；V提取：加入的提取液体积，1mL；T：反应时间：2min；W：样本质量，g；10⁹：单位换算系数，1mol=10⁹nmol。
B、沉淀中PC活力的计算:
酶活定义：每克样本每分钟消耗1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
PC酶活（U/g质量）=ΔA2÷（ε×d）×10⁹×V反总÷（V样×W÷V样总）÷T = 1607×ΔA2÷W
ΔA2：上清测定值；ε：NADH摩尔消光系数，6.22×10³ L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V反总：反应体系总体积，1×10^-3L；V样：反应体系中样本体积，0.05mL；V提取：沉淀重悬体积，1mL；T：反应时间：2min；W：样本质量，g；10⁹：单位换算系数，1mol=10⁹nmol。
C、样本PC总活力的计算:
样本PC总活力即为上清中PC活力与沉淀中PC活力之和。
按样本质量计算：PC（U/g 质量）=1607×ΔA1÷W+1607×ΔA2÷W
实验实例：

1. 取0.1g兔心组织加入1mL提取液进行匀浆研磨，用提取液稀释上清100倍，稀释沉淀4倍，之后按照测定步骤操作，测得计算上清中ΔA测定管=A1测定-A2测定=1.104-0.856=0.248，ΔA空白管=A1空白-A2空白=1.021-0.988=0.033，ΔA1=ΔA测定管-ΔA空白管=0.248-0.033=0.215，沉淀中的ΔA测定管=A1测定-A2测定=1.07-0.716=0.354，ΔA空白管=A1空白-A2空白=1.021-0.988=0.033，ΔA2=ΔA测定管-ΔA空白管=0.354-0.033=0.321；按样本质量计算酶活得：

上清：PC的酶活（U/g 质量）=1607×ΔA1÷W×100(稀释倍数)=1607×0.215÷0.1×100=345505 U/g 质量
沉淀：PC酶活U/g 质量)=1607×ΔA2÷W×4(稀释倍数)=1607×0.321÷0.1×4=20633.88 U/g 质量
样本PC总酶活（U/g 质量）=1607×ΔA1÷W×100(稀释倍数)+1607×ΔA2÷W
=1607×0.215÷0.1×100+1607×0.321÷0.1×4=366138.88 U/g 质量。
相关发表文献：

1. Esmail S. Kakey,Amez A. Ismael. Evaluation of Oxidative Stress Status in Aged Human in relation to some Diseases. International Conference on Pure and Applied Sciences. August 2018;

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