漆酶活性检测试剂盒 其他系列

漆酶活性检测试剂盒说明书

可见分光光度法

货号：BC1630

规格：50T/48S

产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

溶液的配制：

1. 工作液的配制：一瓶试剂二用25 mL试剂一溶解。现用现配。

产品说明：

漆酶（CE1.10.3.2）是一种含铜的多酚氧化酶，属于铜蓝氧化酶家族，漆酶存在菇、菌及植物中，是一种环保型酶，其催化性质在生物检测中有广泛的应用。

漆酶分解底物ABTS产生ABTS自由基，在420nm处的吸光系数远大于底物ABTS，测定ABTS自由基的增加速率，可计算得漆酶活性。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计、低温离心机、1mL玻璃比色皿、可调式移液枪、天平、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水，水浴锅

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）   

1、组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。10000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

2、细胞：按照细胞数量（10⁴个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后4℃，10000g离心10min，取上清置于冰上待测。

3、培养液：直接检测。

二、测定步骤

1、 分光光度计预热30min以上，调节波长至420nm，蒸馏水调零。

2、 水浴锅温度调至45℃。

3、 操作表：在1mL玻璃比色皿中分别加入下列试剂：

三、漆酶活计算

1、按蛋白浓度计算

酶活定义：每毫克蛋白每分钟氧化1nmol底物ABTS所需的酶量为一个酶活力单位。

漆酶酶活（U/mg prot）=ΔA÷（ε×d）×V反总×10⁹÷（V样×Cpr）÷T=61.7×ΔA÷Cpr

2、按样本质量计算

酶活定义：每克样本每分钟氧化1nmol底物ABTS所需的酶量为一个酶活力单位。

漆酶酶活（U/g 质量）=ΔA÷（ε×d）×V反总×10⁹÷（V样×W÷V样总）÷T=61.7×ΔA÷W

3、按细胞数量计算

酶活定义：每10⁴个细胞每分钟氧化1nmol底物ABTS所需的酶量为一个酶活力单位。

漆酶酶活（U/10⁴ cell）=ΔA÷（ε×d）×V反总×10⁹÷（V样×500÷V样总）÷T=0.123×ΔA

4、按液体体积计算

酶活定义：每mL液体每分钟氧化1nmol底物ABTS所需的酶量为一个酶活力单位。

漆酶酶活（U/mL）=ΔA÷（ε×d）×V反总×10⁹÷V样÷T=61.7×ΔA

ε：ABTS摩尔消光系数：36000L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V反总：反应总体积，0.001L；V样：反应中样本体积，0.15mL；V样总：加入提取液体积，1mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL，蛋白浓度需自行测定；W，样本质量，g；T：反应时间，3min；500：细胞总数，500万；10⁹：单位换算系数，1mol=10⁹nmol。

注意事项：

1、工作液需临用前配制，并且尽快使用，4℃保存一周，若变色则不能使用。

2、测定之前进行预实验，若吸光值较高，请将样本用提取液进行适当的稀释再测定，并在计算公式中乘以稀释倍数。

3、空白管为检测各试剂组分质量的检测孔，正常情况下，OD值变化不超过0.05。

实验实例：

1. 取0.1g香菇加1mL提取液进行样本处理，取上清后按照测定步骤操作，测得计算ΔA测定管=A2测定-A1测定=0.657-0.084=0.573，ΔA空白管=A2空白-A1空白=0.087-0.058=0.029，ΔA=ΔA测定管-ΔA空白管=0.573-0.029=0.544，按样本质量计算酶活得：

漆酶酶活（U/g 质量）=61.7×ΔA÷W=61.7×0.544÷0.1=335.648 U/g 质量。

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