NAD-苹果酸酶活性检测试剂盒 微量法

NAD-苹果酸酶（NAD-ME）活性检测试剂盒说明书
微量法
货号: BC1135
规格: 100T/96S
产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

溶液的配制：

1. 试剂二：临用前加入10 mL提取液充分溶解备用；

2. 试剂三：临用前每支加1 mL双蒸水充分溶解备用；

3. 试剂四：用时每支加500 μL双蒸水充分溶解备用；

4. 工作液：在7.5 mL试剂二中加入1 mL试剂三和0.5 mL试剂四，可以根据比例现用现配。

产品说明：
ME广泛存在于微生物、培养细胞、动物和植物胞浆中，尤其在植物组织中活性较高。ME催化苹果酸氧化脱羧的可逆反应，产生丙 酮酸和CO₂，以及伴随NAD(P)⁺的还原反应，是苹果酸代谢的关键酶。ME活性与生物合成和抗氧化密切相关。近年来植物ME活性测定较多，已经成为抗氧化研究的热点。根据辅酶专一性和对底物特异性的不同，可将ME分为NAD-ME(EC1.1.1.38)和NADP-ME(EC1.1.1.40)。
NAD-ME催化NAD⁺还原成NADH，在340nm下测定NADH增加速率。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
紫外分光光度计/酶标仪、低温离心机、水浴锅、可调节移液器、微量石英比色皿/96孔UV板、研钵/匀浆器、蒸馏水。
操作步骤：具体操作步骤详见“产品资料"附件
注意事项：

1. 若A2-A1大于0.5，需将样本用提取液稀释，使A2-A1小于0.5，可提高检测灵敏度。

2. 实验时，样本在冰上放置，以免变性和失活。试剂一37℃或25℃水浴放置。

3. 比色皿中反应液的温度必须保持37℃或25℃，取小烧杯一只装入一定量的37℃或25℃蒸馏水，将此烧杯放入37℃或25℃水浴锅中。在反应过程中把比色皿连同反应液放在此烧杯中。用96孔板做时尽量保持反应温度在37℃或25℃。

4. 最好两个人同时做此实验，一个人比色，一个人计时，以保证实验结果的准确性。用96孔板做时尽量做到样本反应时间一致。

5. 如果ΔA＜0.01，可将反应时间延长到10分钟。

实验实例：

1. 取0.1g肝加入1mL提取液进行匀浆研磨，取上清，按照测定步骤操作，使用微量石英比色皿测得计算ΔA=A2-A1=0.893-0.6814=0.2116，按样本质量计算酶活得：

NAD-ME（U/g 质量）=965×ΔA÷W=965×0.2116÷0.1=2041.94 U/g 质量。
参考文献：

1. Spampinato C P, Colombo S L, Andreo C S. Interaction of analogues of substrate with NADP-malic enzyme from maize leaves[J]. Photosynthesis research, 1994, 39(1): 67-73.

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