乙醛脱氢酶(ALDH)活性检测试剂盒 微量法

乙醛脱氢酶（ALDH）活性检测试剂盒说明书
微量法
注意：本产品试剂有所变动，请注意并严格按照该说明书操作。
货号：BC0755
规格：100T/96S
产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

溶液的配制：

1. 试剂二：临用前取一支试剂二加入1.5mL蒸馏水溶解，用不完的试剂-20℃分装保存4周，避免反复冻融；

2. 试剂四：为有毒试剂，实验室注意防护；

3. 工作液：临用前根据样本数量按照试剂一：试剂二：试剂三：试剂四=60µL：20µL：4µL：6µL（1T）的比例配制工作液，现用现配。

产品说明：
乙醛脱氢酶（acetaldehyde dehydrogenase，ALDH）是醛脱氢酶的一种，能够催化乙醛、正 丁醛、肉桂醛、苯甲醛等有毒醛类快速脱氢，催化醛类物质氧化生成羧酸，清除有害醛类并减少脂类的过氧化反应，被认为是生物体内活性氧物质的解毒剂。乙醛脱氢酶不仅能够转化代谢对生物体有害的醛类，还在分子生物学以及相关疾病的检测方面有较广泛的研究应用。

乙醛脱氢酶催化乙醛和NAD⁺转化为乙酸和NADH，利用NADH在340nm处吸光值的变化即可计算得到乙醛脱氢酶的活性。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
紫外分光光度计/酶标仪、台式离心机、分析天平、水浴锅/恒温培养箱、微量石英比色皿/96孔UV板、可调式移液枪、研钵/匀浆器/细胞超声破碎仪、冰和蒸馏水。
操作步骤：
一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1. 组织样本：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例加入提取液（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液）进行冰浴匀浆，于4℃，10000g离心20min，取上清置于冰上待测。

2. 细胞/细菌样本：按照细胞/细菌数量（10⁴个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例加入提取液（建议500万细胞/细菌加入1mL提取液），冰浴超声波破碎（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；于4℃，10000g离心20min，取上清置于冰上待测。

3. 血清（浆）等液体：直接检测。若液体有浑浊则离心后进行测定。

二、测定步骤

1. 紫外分光光度计/酶标仪预热30min以上，调节波长至340nm，紫外分光光度计蒸馏水调零。

2. 工作液37℃预热10min。

3. 操作表：

三、ALDH酶活计算
A 按微量石英比色皿计算：

1. 按蛋白浓度计算

酶活定义：每毫克蛋白每分钟生成1nmol的NADH定义为1个酶活单位。
ALDH酶活（U/mg prot）=ΔA÷（ε×d）×10⁹×V反总÷（V样×Cpr）÷T=26.795×ΔA÷Cpr

1. 按样本质量计算

酶活定义：每克样本每分钟生成1nmol的NADH定义为1个酶活单位。
ALDH酶活（U/g 质量）=ΔA÷（ε×d）×10⁹×V反总÷（V样×W÷V样总）÷T=26.795×ΔA÷W

1. 按细胞/细菌数量计算

酶活定义：每10⁶个细胞/细菌每分钟生成1nmol的NADH定义为1个酶活单位。
ALDH酶活（U/10⁶ cell）=ΔA÷（ε×d）×10⁹×V反总÷（V样÷V样总×N）÷T=26.795×ΔA÷N

1. 按液体体积计算

酶活定义：每mL样本每分钟生成1nmol的NADH定义为1个酶活单位。
ALDH酶活（U/mL）=ΔA÷（ε×d）×10⁹×V反总÷V样÷T=26.795×ΔA
ε：NADH摩尔消光系数，6.22×10³ L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V反总：反应体系总体积，2×10^-4L；V样：反应体系中加入样本上清体积，0.04mL；V样总：加入提取液体积，1mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL，需自行测定；W：样本质量，g；N：细胞/细菌总数，以10⁶计；T：反应时间，30min；10⁹：单位换算系数，1mol=10⁹nmol。
B 按96孔UV板计算：



将上述公式中的d-1cm改为d-0.6cm（96孔UV板光径）进行计算即可。
注意事项：

1. 空白管为检测各试剂组分质量的检测孔，正常情况下，其OD值不超过0.3（比色皿）0.2（96孔板），变化不超过0.01。

2. 样品ΔA大于1时，建议将样本用提取液稀释后再进行测定。当ΔA小于0.01时，可以延长反应时间（60min或更长时间）来测定。计算时注意同步更改计算公式。

实验实例：

1. 取0.1084g兔肝脏，加入1mL提取液进行冰浴匀浆研磨，离心取上清，之后按照测定步骤操作，用96孔UV板测得计算ΔA测定=A2测定-A1测=0.878-0.838=0.040，ΔA空白=A2空白-A1空白=0，ΔA=ΔA测定-ΔA空白=0.040-0=0.040，按样本质量计算酶活得：

ALDH酶活（U/g质量）=0.040÷（6.22×10³×0.6）×10⁹×2×10^-4÷（0.04×0.1023÷1）÷30=16.479 U/g质量。

1. 取0.1100g小鼠肝脏，加入1mL提取液进行冰浴匀浆研磨，离心取上清，之后按照测定步骤操作，用96孔UV板测得计算ΔA测定=A2测定-A1测=1.624-0.798=0.826，ΔA空白=A2空白-A1空白=0，ΔA=ΔA测定-ΔA空白=0.826-0=0.826，按样本质量计算酶活得：

ALDH酶活（U/g质量）=0.826÷（6.22×10³×0.6）×10⁹×2×10^-4÷（0.04×0.1023÷1）÷30=335.343 U/g质量。
相关发表文献：
[1] Tongmeng Jiang,Jinmin Zhao,Shan Yu,et al. Untangling the response of bone tumor cells and bone forming cells to matrix stiffness and adhesion ligand density by means of hydrogels. Biomaterials. January 2019;188:130-143.(IF5.452)
[2] Chong Li, Shi Gao, Xiaotong Li,et al. Efficient metabolic evolution of engineered Yarrowia lipolytica for succinic acid production using a glucose-based medium in an in situ fibrous bioreactor under low-pH condition. Biotechnology for Biofuels. August 2018;(IF5.452)
[3] Yufei He,Xiaoyan Ci,Ying Xi,et al. Untangling the response of bone tumor cells and bone forming cells to matrix stiffness and adhesion ligand density by means of hydrogels. Biomaterials. September 2018;(2019)188:130-143.(IF8.806)
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