酰基转移酶(AAT)活性检测试剂盒 微量法

酰基转移酶（AAT）活性检测试剂盒说明书
微量法
注意：本产品试剂有所变动，请注意并严格按照该说明书操作。
货号：BC2355
规格：100T/96S
产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

溶液的配制：

1. 提取液：内含不溶物，使用前摇匀。

2. 试剂二：临用前取一支试剂二加1 mL蒸馏水充分溶解，未用完的试剂2-8℃可以保存2周。(为了延长使用时间，因此多给一支试剂二)

产品说明：
AAT是一个多功能蛋白大家族，主要负责催化生物体内各种酰基化和去酰基化反应，在基因表达、代谢和信号传导中具有重要作用。
AAT催化乙酰CoA转移乙酰基到丁醇，同时还原DTNB生成TNB；TNB在412nm有吸收峰，测定412 nm吸光度增加速率，来计算AAT活性。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅/恒温培养箱、可调式移液器、微量玻璃比色皿/96孔板、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。
操作步骤：具体操作步骤详见“产品资料"附件
一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）
1、组织样本：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。4℃，15000 g离心20min，取上清液待测。
2、血清（浆）样本：直接检测。（若液体有浑浊则离心后进行测定）
二、测定步骤

1. 分光光度计/酶标仪预热30min 以上，调节波长至412nm，蒸馏水调零。

2. 试剂一在37℃水浴保温20 min以上。

3. 样本测定：

将上述试剂按顺序加入微量石英比色皿/96孔板中，加试剂四的同时开始计时，在412nm波长下记录10s时的初始吸光度A1和130s后的吸光值A2，计算ΔA空=A2空-A1空；ΔA测=A2测-A1测，ΔA=ΔA测-ΔA空。空白管只需做1-2次。

注意事项：

1. 上清液蛋白质含量需要另外测定。

2. 当吸光值大于1时，建议稀释后测量。

3. 建议一个一个样本测定，一人比色一人计时。

4. 如果ΔA测小于0.01，可以延长反应时间，如测定10 s和310 s的吸光度，相应修改计算公式中反应时间。

实验实例：

1. 取0.1g肾脏加入1mL提取液进行样本处理，取上清后稀释4倍后按测定步骤操作，用微量石英比色皿测得ΔA空=A2空-A1空=0.0849-0.08=0.0049、ΔA测=A2测-A1测=0.69-0.4929=0.1971、ΔA=ΔA测-ΔA空=0.1971-0.0049 =0.1922，按样本质量计算酶活得：AAT (U/g 质量) =5000×ΔA÷W×4（稀释倍数）=38440 U/g 质量。

2. 取兔血清直接按照测定步骤操作，测得ΔA空=A2空-A1空=0.0849-0.08=0.0049、ΔA测=A2测-A1测=0.629-0.5342 =0.0948、ΔA=ΔA测-ΔA空=0.0948-0.0049=0.0899，按血清体积计算酶活得：AAT (U/mL 血清) =5000×ΔA=5000×0.0899=449.5 U/mL 血清。

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