磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶检测试剂盒 微量法

磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（PEPCK）活性检测试剂盒说明书

微量法

货号：BC3315

规格：100T/96S

产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

溶液的配制：

1、 试剂二：临用前加入15 mL试剂一溶解。可溶解后分装-20℃保存，避免反复冻融。

2、 试剂三：液体置于试剂瓶内EP管内。临用前加入蒸馏水按体积比1：120稀释，现用现配。

3、 试剂四：液体置于试剂瓶内EP管内。临用前加入蒸馏水按体积比7：250稀释，现用现配。

4、 试剂五：粉剂置于试剂瓶内玻璃管内。临用前加入2.5 mL蒸馏水充分溶解；可溶解后分装-20℃保存，避免反复冻融。

5、 工作液的配制：将试剂二、试剂三、试剂四按7:1:1（V:V:V）的比例配制工作液，工作液现用现配。

产品说明：

PEPCK（EC 4.1.1.32）广泛存在于动物、开花植物、藻类、部分真菌和细菌中。该酶催化草酰乙酸转化为磷酸烯醇式丙酮酸，是调节糖异生途径的第一限速酶。

PEPCK催化草酰乙酸生成磷酸烯醇式丙酮酸和CO₂，丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶进一步依次催化NADH氧化生成NAD⁺，在340nm下测定NADH下降速率，即可反映PEPCK活性。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

紫外分光光度计/酶标仪、低温离心机、水浴锅、微量石英比色皿/96孔UV板、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液）进行冰浴匀浆，然后8000g，4℃，离心10min，取上清，置冰上待测。 

细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（10⁴个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20%或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

血清（浆）样本：直接检测。

二、测定步骤

1、 紫外分光光度计/酶标仪预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。

2、 将工作液置于37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)预热5分钟。

3、 操作表：在微量石英比色皿/96孔UV板中依次加入下列试剂：

三、PEPCK酶活计算

A 按微量石英比色皿计算：

1、 按蛋白浓度计算

酶活定义：每mg组织蛋白每分钟消耗1 nmol 的NADH定义为一个酶活力单位。

PEPCK酶活（U/mg prot）= ΔA÷（ε×d）×10⁹×V反总÷（V样×Cpr）÷T= 3215.4×ΔA÷Cpr

2、 按样本质量计算

酶活定义：每g组织每分钟消耗1 nmol 的NADH定义为一个酶活力单位。

PEPCK酶活（U/g 质量）= ΔA÷（ε×d）×10⁹×V反总÷（V样×W÷V样总）÷T=3215.4×ΔA÷W

3、 按细菌或细胞数量计算

酶活定义：每10⁴个细菌或细胞每分钟消耗1 nmol 的NADH定义为一个酶活力单位。

PEPCK酶活（U/10⁴ cell）= ΔA÷（ε×d）×10⁹×V反总÷（500×V样÷V样总）÷T=6.43×ΔA

4、 按血清（浆）体积计算

酶活定义：每毫升血清（浆）每分钟消耗1 nmol 的NADH定义为一个酶活力单位。

PEPCK（U/mL）＝ΔA÷（ε×d）×10⁹×V反总÷V样÷T=3215.4×ΔA

ε：NADH摩尔消光系数，6.22×10³ L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V反总：反应体系总体积，0.0002L；V样：反应体系中样本体积，0.01mL；V样总：加入提取液体积，1mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL，蛋白浓度自行测定；W：样本质量，g，T：反应时间：1min；500：细菌或细胞总数，500万；10⁹：单位换算系数，1mol=10⁹nmol。

B 按96孔UV板计算：

将上述公式中的d-1cm改为d-0.6cm（96孔板光径）进行计算即可。

注意事项：

1、 当A1小于1或ΔA大于0.6时（96孔UV板是当A1小于0.6或ΔA大于0.4时），建议将样本稀释适当倍数后再进行测定，以提高检测灵敏度。

2、 酶活性高的样本如动物肝、肾等组织，建议将提取液稀释5倍或5倍以上测定。

3、 空白管为检测各试剂组分质量的检测孔，正常情况下，变化不超过0.06。

4、 加样、混匀等步骤要迅速，秒表计时要准确。

实验实例：

1、 取0.1g肝脏加入1mL提取液进行匀浆研磨，取上清后再用提取液稀释2倍，之后按照测定步骤操作，用微量石英比色皿测得计算ΔA测定管= A1测定-A2测定=1.1298-0.4464=0.6834，ΔA空白管=A1空白-A2空白=1.3819-1.3463=0.0356，ΔA=ΔA测定管-ΔA空白管=0.6834-0.0356=0.6478，按样本质量计算酶活得：

PEPCK酶活（U/g质量）= 3215.4×ΔA÷W×2（稀释倍数）=3215.4×0.6478÷0.1×2=41658.72 U/g 质量。

2、 取0.1g芦荟加入1mL提取液进行匀浆研磨，取上清后按照测定步骤操作，用微量石英比色皿测得计算ΔA测定管= A1测定-A2测定=1.4015-1.2665=0.135，ΔA空白管= A1空白-A2空白=1.3819-1.3463=0.0356，ΔA=ΔA测定管-ΔA空白管=0.135-0.0356=0.0994，按样本质量计算酶活得：

PEPCK酶活（U/g质量）= 3215.4×ΔA÷W=3215.4×0.0994÷0.1=3196.108 U/g 质量。

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