乙酸激酶（ACK）活性检测试剂盒 微量法

乙酸激酶（ACK）活性检测试剂盒说明书
微量法
注意：本产品试剂有所变动，请注意并严格按照该说明书操作。
货号：BC3175
规格：100T/96S
产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

溶液的配制：

1. 提取液：临用前将试剂九加入到提取液中，并于2-8℃保存；

2. 试剂二：临用前每瓶加入1 mL蒸馏水，充分溶解待用。用不完的试剂仍2-8℃保存；

3. 试剂三：临用前每瓶加入1 mL蒸馏水，充分溶解待用；用不完的试剂-20℃保存；

4. 试剂四：临用前每瓶加入2 mL蒸馏水，充分溶解待用；用不完的试剂-20℃保存；

5. 试剂五：临用前每支加入0.5 mL蒸馏水，充分溶解待用；用不完的试剂-20℃保存；

6. 试剂六：液体置于试剂瓶内EP管中。临用前根据样本量将试剂六、蒸馏水按43:457（V:V）的比例配制备用，现用现配；

7. 试剂七：液体置于试剂瓶内EP管中。临用前根据样本量将试剂七、蒸馏水按1:9（V:V）的比例配制备用，现用现配；

8. 试剂八：临用前加入5 mL蒸馏水，充分溶解待用。用不完的试剂仍2-8℃保存；

9. 工作液：吸取0.06 mL 试剂二、0.2 mL试剂三、0.13 mL试剂四、0.04 mL试剂五、0.04 mL试剂六、0.04 mL试剂七、0.2 mL试剂八混匀，也可根据比例现用现配，于冰上备用。

产品说明：
ACK广泛存在于生物体内，催化乙酸和ATP生成乙酰磷酸和ADP，是细菌碳代谢和能量代谢的关键酶，尤其是在古细菌甲烷合成代谢中起着中枢作用。
测定原理如下：（1）ACK催化乙酸钠和ATP生成乙酰磷酸和ADP，（2）丙 酮酸激酶催化ADP和PEP生成ATP和丙 酮酸，（3）乳酸脱氢酶催化丙 酮酸和NADH生成乳酸和NAD⁺，（4）在340nm下测定NADH氧化生成NAD⁺

速率，即可反映ACK活性。
注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
台式离心机、紫外分光光度计/酶标仪、水浴锅、微量石英比色皿/96孔UV板、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰、蒸馏水。

操作步骤：具体操作步骤详见“产品资料"附件

注意事项：

1. 测定过程中样本和所有试剂在冰上放置，以免变性和失活。

2. 反应液的温度必须保持37℃或25℃，比色皿测定时可取小烧杯一只装入一定量的37℃或25℃蒸馏水，将此烧杯放入37℃或25℃水浴锅中。在反应过程中把比色皿连同反应液放在此烧杯中。

3. ΔA大于1时，建议稀释后测量，注意计算公式乘以稀释倍数；ΔA小于0.01时，建议延长反应时间测量，注意计算公式变化。

实验实例：

1. 取0.1g肾脏组织样本，加入1mL提取液进行匀浆研磨，取上清后按照测定步骤操作，用微量石英比色皿测得计算ΔA测定=A测定1-A测定2=1.7666-1.0488=0.7178，ΔA空白=A空白1-A空白2=1.3902-1.3553=0.0349，ΔA=ΔA测定-ΔA空白=0.7178-0.0349=0.6829，按样本质量计算酶活得：ACK（U/g 质量）=536×ΔA÷W=536×0.6829÷0.1=3660.344 U/g 质量。

2. 取500万大肠杆菌加入1mL提取液超声破碎，离心，取上清后按照测定步骤操作，用微量石英比色皿测得计算ΔA测定=A测定1-A测定2=1.3965-1.3503=0.0462，ΔA空白=A空白1-A空白2=1.3902-1.3553=0.0349，ΔA=ΔA测定-ΔA空白=0.0462-0.0349=0.0113，按细菌数量计算酶活得：ACK（U/10⁴ cell）=1.072×ΔA=1.072×0.0113=0.0121136 U/10⁴ cell。

参考文献：

1. Mukhopadhyay S, Hasson M S, Sanders D A. A continuous assay of acetate kinase activity: Measurement of inorganic phosphate release generated by hydroxylaminolysis of acetyl phosphate[J]. Bioorganic chemistry, 2008, 36(2): 65-69.

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