4-香豆酸：辅*A连接酶活性检测试剂盒 其它

4-香豆酸：辅*A连接酶（4CL）活性检测试剂盒说明书
紫外分光光度法
货号: BC4220
规格: 50T/48S
产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

溶液的配制：

1. 提取液：内含不溶物，使用前摇匀；

2. 试剂二：临用前加入6 mL蒸馏水溶解，可以分装后-20℃保存，避免反复冻融；

3. 试剂四：临用前用6 mL蒸馏水溶解备用，可以分装后-20℃保存，避免反复冻融；

4. 试剂五：加入1 mL乙醇溶解，临用前用蒸馏水稀释40倍后备用，现用现配；

5. 工作液的配制：按体积比将试剂二：试剂三：试剂四：试剂五=1:1:1:1的比例配制工作液，现用现配。

产品说明：
4-香豆酸：辅*A连接酶（4-coumarate:CoA ligase，4CL）是木质素生物合成的关键酶之一，主要催化肉桂酸及其羟基或者甲氧基衍生物生成相应的辅*A酯，这些中间产物随后进入苯丙类衍生物支路合成途径。该酶主要存在于高等植物、酵母和菌类中，研究该酶可以探讨多种生物细胞发育过程中木质素沉积的代谢机理，为减少水果石细胞含量而提高其品质提供依据。
4CL催化4-香豆酸和CoA生成4-香豆酸CoA，其在333nm下测有特征吸收峰，测定4-香豆酸CoA的生成速率，即可反映4CL活性。
注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
紫外分光光度计、低温台式离心机、水浴锅、1mL石英比色皿、可调式移液枪、研钵/匀浆器、EP管、冰和蒸馏水。
操作步骤：

• 样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1. 细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（10⁴个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20%或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

2. 组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

二、测定步骤

1. 紫外分光光度计预热30min以上，调节波长至333nm，蒸馏水调零。

2. 操作表（在1.5mLEP管中进行下列操作）：

三、4CL活性计算

1. 按样本蛋白浓度计算：

单位定义：每mg组织蛋白每小时生成1nmol 4-香豆酸辅*A定义为一个酶活力单位。
4CL（U/mg prot）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×10⁹]÷(V样×Cpr) ÷T=476.19×ΔA÷Cpr

1. 按样本质量计算：

单位定义：每g组织每小时生成1nmol 4-香豆酸辅*A定义为一个酶活力单位。
4CL（U/g 质量）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×10⁹]÷(W ×V样÷V样总) ÷T=476.19×ΔA÷W

1. 按细菌或细胞数量计算：

单位定义：每1万个细菌或细胞每小时生成1nmol 4-香豆酸辅*A定义为一个酶活力单位。
4CL（U/10⁴ cell）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×10⁹]÷(500×V样÷V样总) ÷T=0.9124×ΔA
V反总：反应体系总体积，1×10^-3L；ε：4-香豆酸辅*摩尔消光系数，2.1×10⁴L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.1mL；V样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，1h；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500万；10⁹：单位换算系数，1mol=10⁹nmol。
注意事项：

1. 若ΔA大于0.5，将样本用蒸馏水稀释后再进行测定。

2. 建议一次测定不要测定过多样本以免耽误过多的酶促反应时间。

3. 空白管为检测各试剂组分质量的检测孔，正常情况下，变化不超过0.01。

实验实例：

1. 取0.1g芥菜加1mL提取液进行样本处理，取上清后按照测定步骤操作，测得ΔA测定管=A2测定管-A1测定管=0.784-0.655=0.129，ΔA空白管= A2空白管-A1空白管=0，ΔA=ΔA测定管-ΔA空白管=0.129，按样本质量计算酶活得：4CL（U/g 质量）=476.19×ΔA÷W=476.19×0.129÷0.1=614.29 U/g 质量。

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