ATP-柠檬酸裂解酶活性检测试剂盒 微量法

ATP-柠檬酸裂解酶（ACL）活性检测试剂盒说明书

微量法

注意：本产品试剂有所变动，请注意并严格按照该说明书操作。

货号：BC4245

规格：100T/96S

产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

溶液的配制：

1、 提取液二：为易挥发试剂，用完后尽快密封，-20℃保存；

2、 试剂二：临用前取1支加入0.5mL试剂一，充分溶解；用不完的试剂-20℃分装保存4周，避免反复冻融；

3、 试剂三：临用前取1瓶加入2.25 mL试剂一，充分溶解；用不完的试剂-20℃分装保存4周，避免反复冻融；

4、 试剂四：临用前取1支加入0.5 mL试剂一，充分溶解；用不完的试剂可分装后-20℃保存4周，避免反复冻融；

5、 试剂五：使用前请先离心再用移液枪吹打混匀。取3 μL试剂五加1000 μL蒸馏水充分混合（约100T），现用现配，也可根据样本量按比例配制；

6、 提取液的配制：按提取液一︰提取液二=990︰10（V︰V）的比例配制，根据样本量现配现用，禁止将提取液二一次性全部加入提取液一混匀分装待用。

产品说明：

ATP-柠檬酸裂解酶（ATP-citrate lyase，ACL）是催化柠檬酸生成乙酰辅*A的关键胞质酶，其催化产生的乙酰辅*A是合成脂肪酸与胆*醇等脂类物质的主要原料，并可参与相关重要蛋白的修饰作用，是体内能源物质代谢的枢纽性物质。在ATP和辅*A存在的情况下，ACL能将柠檬酸催化裂解为乙酰辅*A、草酰乙酸、ADP和磷酸盐，苹果酸脱氢酶进一步催化草酰乙酸和NADH生成苹果酸和NAD⁺，导致340nm处光吸收下降。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

紫外分光光度计/酶标仪、天平、台式低温离心机、微量石英比色皿/96孔UV板、可调式移液枪、研钵/匀浆器/细胞超声破碎仪、水浴锅/恒温培养箱、冰、蒸馏水。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1、组织：按照质量（g）︰提取液体积(mL)为1︰5~10的比例（建议称取约0.1g，加入1mL提取液）进行冰浴匀浆。于4℃，8000g离心10min，取上清，置于冰上待测。

2、细胞或细菌：按照细胞或细菌数量（10⁴个）︰提取液体积（mL）为500~1000︰1的比例（建议500万细胞或细菌加入1mL提取液），冰浴超声波破碎细胞或细菌（功率300W，超声3秒，间隔7秒，总时间3min），于4℃，8000g离心10min，取上清，置于冰上待测。

3、血清（浆）或其他液体：直接检测。

二、测定步骤

1、 分光光度计/酶标仪预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。

2、 将试剂一置于37℃水浴10min。

3、 操作表 (在微量石英比色皿/96孔UV板中依次加入下列试剂) ：

注意：如果样本量大，可按试剂一︰试剂二︰试剂三︰试剂四︰试剂五=152︰4︰20︰4︰10的比例配制成工作液使用，工作液应根据样本量现配现用。

三、ACL活性计算

A、按微量石英比色皿计算：

1. 按样本蛋白浓度计算

单位定义：每mg蛋白每分钟消耗1nmol NADH定义为一个酶活力单位

ACL活性（U/mg prot）=[ΔA×V反总×10⁹÷（ε×d）]÷(V样×Cpr) ÷T=1607.7×ΔA÷Cpr

2. 按样本质量计算

单位定义：每g组织每分钟消耗1nmol NADH定义为一个酶活力单位。

ACL活性（U/g 质量）=[ΔA×V反总×10⁹÷（ε×d）]÷(W×V样÷V样总)÷T=1607.7×ΔA÷W

3. 按照细胞数量计算

单位定义：每1万个细胞或细菌每分钟消耗1nmol NADH定义为一个酶活力单位。

ACL活性（U/10⁴ cell）=[ΔA×V反总×10⁹÷（ε×d）] ÷(N×V样÷V样总) ÷T=1607.7×ΔA÷N

4. 按液体体积计算

单位定义：每mL液体每分钟消耗1nmol NADH定义为一个酶活力单位。

ACL（U/mL）=[ΔA×V反总×10⁹÷（ε×d）]÷V 样÷T=1607.7×ΔA

V反总：反应总体积，2×10^-4L；10⁹：单位换算系数，1mol=10⁹nmol；ε：NADH摩尔消光系数，6.22×10³ L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.01mL；V样总：加入提取液体积，1mL；Cpr：蛋白浓度，mg/mL，蛋白浓度自行测定；W：样本质量，g；N：细胞或细菌数量，以万计；T：反应时间，2min。

B、按照96孔UV板计算

5. 按样本蛋白浓度计算

单位定义：每mg蛋白每分钟消耗1nmol NADH定义为一个酶活力单位

ACL活性（U/mg prot）=[ΔA×V反总×10⁹÷（ε×d）]÷(V样×Cpr) ÷T=2679.5×ΔA÷Cpr

6. 按样本质量计算

单位定义：每g组织每分钟消耗1nmol NADH定义为一个酶活力单位。

ACL活性（U/g 质量）=[ΔA×V反总×10⁹÷（ε×d）]÷(W×V样÷V样总)÷T=2679.5×ΔA÷W

7. 按照细胞数量计算

单位定义：每1万个细胞或细菌每分钟消耗1nmol NADH定义为一个酶活力单位。

ACL活性（U/10⁴ cell）=[ΔA×V反总×10⁹÷（ε×d）] ÷(500×V样÷V样总) ÷T=5.359×ΔA

8. 按液体体积计算

单位定义：每mL液体每分钟消耗1nmol NADH定义为一个酶活力单位。

ACL（U/mL）=[ΔA×V反总×10⁹÷（ε×d）]÷V 样÷T=2679.5×ΔA

V反总：反应总体积，2×10^-4L；10⁹：单位换算系数，1mol=10⁹nmol；ε：NADH摩尔消光系数，6.22×10³ L/mol/cm；d：比色皿光径，0.6cm；V样：加入样本体积，0.01mL；V样总：加入提取液体积，1mL；Cpr：蛋白浓度，mg/mL，蛋白浓度自行测定；W：样本质量，g；500：细胞或细菌数量，500万，T：反应时间，2min。

实验实例：

1. 取0.1g黑麦草，加入1mL提取液进行冰浴匀浆，于4℃，8000g离心10min，取上清，按照测定步骤操作，用微量石英比色皿测得计算ΔA测定管= A1测定-A2测定=1.7569-1.7034=0.0535，ΔA空白管=A1空白-A2空白=0.459-0.457=0.002，ΔA=ΔA测定管-ΔA空白管=0.0535-0.002=0.0515，按样本质量计算得：ACL活性（U/g 质量）=1607.7×ΔA÷W=827.9655 U/g 质量。

2. 取0.1g肝脏组织，加入1mL提取液进行冰浴匀浆，于4℃，8000g离心10min，取上清，按照测定步骤操作，用微量石英比色皿测得计算ΔA测定管= A1测定-A2测定=1.2341-1.0503=0.1838，ΔA空白管=A1空白-A2空白=0.459-0.457=0.002，ΔA=ΔA测定管-ΔA空白管=0.1838-0.002=0.1818，按样本质量计算得：

ACL活性（U/g 质量）=1607.7×ΔA÷W=2922.7986 U/g 质量。

相关系列产品：

BC0750/BC0755 乙醛脱氢酶（ALDH）活性检测试剂盒

BC0410/BC0415 乙酰辅*A羧化酶（ACC）活性检测试剂盒

BC1980/BC1985 总胆*醇（TC）含量检测试剂盒

ATP-柠檬酸裂解酶活性检测试剂盒 微量法 ATP-柠檬酸裂解酶活性检测试剂盒 微量法