Caspase-3活性测定试剂盒 比色法

Caspase-3活性检测试剂盒说明书
比色法
货号：BC3830
规格：20T、50T、100T
产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

溶液的配制：

1. 试剂一：分装-20℃保存。

2. 试剂二：分装-20℃保存。

3. 标准品：pNA标准溶液，5 mmol/L。标准溶液在4℃条件下为浑浊状态，溶解即可变为澄清状态，不影响使用。

4. 标准品稀释液配制：取9 mL试剂一加入1 mL试剂二，充分混匀待用。（也可按照试剂一：试剂二=9:1的比例，自行配制）。

产品说明：
Caspase是参与细胞凋亡过程的蛋白酶家族，包含10多个成员。Caspase-3是凋亡过程中最主要的终末蛋白酶，也是研究最多caspase；它激活pro-caspase-2,6,7,9特异水解多种关键凋亡蛋白如 PARP，介导染色质固缩、凋亡小体生成、核 DNA 断裂。测定原理基于Caspase-3 特异水解多肽底物 DEVD-pNA (Asp-Glu-Val-Asp-p-nitroanilide)，释放的游离硝 基苯胺 pNA在405 nm有最大吸收峰。采用可见光光度比色法测定 pNA 而得到 Caspase活性。适用于检测哺乳动物组织、细胞Caspase-3活性。
注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：

可见分光光度计/酶标仪、100μL玻璃比色皿/96孔板、台式离心机、水浴锅/恒温培养箱、可调式移液器、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。
操作步骤：
一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）
1、培养细胞：先收集细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细胞数量（约10⁶个）加100 μL试剂二（若裂解不充分可提高至150-200 μL），震荡重悬沉淀，置冰上静置15 min，4℃，15000g离心10-15min，取上清置冰上待测。

2、组织：按照组织质量（g）：试剂二体积（mL）为1：5~10的比例（建议称取约0.1 g组织，加入1 mL试剂二），冰浴研磨或充分剪碎，置冰上静置15 min，4℃，15000g离心10-15min，取上清置冰上待测。  
二、测定步骤

1. 可见分光光度计/酶标仪预热30min以上，调节波长至405nm，蒸馏水调零。

2. 临用前用标准品稀释液将5 mmol/L pNA标准品稀释至200、100、50、25、12.5、0 μmol/L的标准溶液待用。

3. 样本测定（在96孔板/EP管中按顺序加入以下试剂）

三、Caspase-3活性计算
1. 标准曲线的建立：
根据标准管的浓度（x，μmol/L）和ΔA标准（y，减去浓度为0的空白管）做标准方程。将ΔA测定代入标准方程得到x（μmol/L）。
2. 按酶活性增加百分比计算
Caspase-3活性增加百分比=（实验处理组A测定-A空白管）/（实验对照组A测定-A空白管）×100%
该方法简单可靠，可粗略反应酶活性情况。
3. 按酶活计算
参考Chemicon公司的caspase酶活力单位的定义：One unit is the amount of enzyme that will cleave 1.0 nmol of the colorimetric pNA-substrate per hour at 37℃ under saturated substrate concentrations。即一个酶活力单位定义为当底物饱和时，在37℃一个小时内可以剪切1nmol pNA底物产生1nmol游离 pNA的酶量。这样就可以计算出样品中含有多少个酶活力单位的caspase酶活性。
Caspase-3活性（U/mg prot）=x×V反总÷（V样×Cpr）÷T×10³=2x÷Cpr÷T
V反总：反应体系总体积，0.1mL=10^-4L；V样：加入的样本体积，0.05mL；T：反应时间，h；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；10³：单位换算系数，1μmol =10³nmol。
注意事项：
1、由于试剂二中含有还原剂（DTT），建议将样品用水稀释2倍后，用Bradford法测定蛋白浓度，以降低DTT对蛋白浓度测定的干扰。不建议使用BCA法测定蛋白浓度。
2、Caspase活性测定值低最常见的原因是细胞未发生凋亡或细胞量太少，其次是观测时间不恰当。诱导凋亡时，并非剂量越大时间越长Caspase活性就越高。建议设置不同剂量和时间点如0、2、4、8、16、24小时，以检测最佳的观察点。



3、所测样本的值高于标准曲线上，可用试剂二稀释样本后重新测定。
4、盖紧96孔板盖子并用封口膜密封。37 ºC孵育，肉眼可见颜色变黄时的OD405值约为0.2，此时即可测定。颜色变化不明显可延长反应或过夜，但酶活性较强时，孵育时间过长将导致反应失去线性关系。
相关发表文献：
[1] Wang B , Wang K , Jin T , et al. NCK1-AS1 enhances glioma cell proliferation, radioresistance and chemoresistance via miR-22-3p/IGF1R ceRNA pathway[J]. Biomedicine & Pharmacotherapy, 2020, 129:110395.
[2] Wang Z , Xu J H , Mou J J , et al. Novel ultrastructural findings on cardiac mitochondria of huddling Brandt's voles in mild cold environment[J]. Comparative Biochemistry and Physiology - Part A Molecular & Integrative Physiology, 2020, 249:110766.
[3] Wang Z , Xu J H , Mou J J , et al. Novel ultrastructural findings on cardiac mitochondria of huddling Brandt's voles in mild cold environment[J]. Comparative Biochemistry and Physiology - Part A Molecular & Integrative Physiology, 2020, 249:110766.
参考文献：

1. Cohen GM. Caspases: the executioners of apoptosis. Biochem J, 1997, 326: 1-16.

2. Janicke R U, Sprengart M L, Wati M R, et al. Emerging role of caspase-3 in apoptosis[J]. Cell Death and Differentiation, 1999, 6:99-104.

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