线粒体呼吸链复合体Ⅰ活性测试盒 微量

线粒体呼吸链复合体Ⅰ/NADH-CoQ还原酶活性检测试剂盒说明书
微量法
注意：本产品试剂有所变动，请注意并严格按照该说明书操作。
货号：BC0515
规格：100T/96S
产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

溶液的配制：

1. 试剂二：临用前取一支加入1 mL丙 酮，充分溶解，2-8℃可保存1个月（1瓶粉剂即可做100T，为延长试剂盒使用时间，故此产品多给一支）；

2. 试剂三：临用前加入0.1mL 丙 酮，丙 酮易挥发，使用完毕后注意封口，-20℃可保存2个月；

3. 试剂三工作液：临用前根据用量将试剂三：丙 酮=5μL：0.5mL（约50T）混合备用，现用现配；

4. 试剂四：临用前取一支加入1.6mL蒸馏水（约100T），充分溶解，-20℃可保存1个月，避免反复冻融（1瓶粉剂即可做100T，为延长试剂盒使用时间，故此产品多给一支）；

5. 工作液的配制：根据用量将丙 酮：试剂二：试剂三工作液=250μL：250μL：500μL（约50T）混合备用，现配现用。

产品说明：
复合体Ⅰ（EC 1.6.5.3）又称NADH-CoQ还原酶或NADH脱氢酶，广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞的线粒体中，是线粒体内膜中最大的蛋白复合物。该酶催化一对电子从NADH传递给CoQ，同时可使O₂还原生成O^2-，是呼吸电子传递链上产生O^2-的主要部位。测定该酶活性，不仅可以反映呼吸电子传递链（ETC）状态，而且可以反映活性氧（ROS）生成状态。
复合体Ⅰ能够催化NADH脱氢生成NAD⁺，在340nm下测定NADH的氧化速率计算出该酶活性的大小。


注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
紫外分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅/恒温培养箱、可调式移液器、微量石英比色皿/ 96孔UV板、研钵/匀浆器、细胞超声破碎仪、丙 酮、冰和蒸馏水。

操作步骤：具体操作步骤详见“产品资料"附件
注意事项：

1. 为保证实验结果的准确性，需先取1-2个样做预实验，如果测定的吸光值过高（A1高于1.5），可用蒸馏水稀释上清液后再测定。计算结果时注意乘以稀释倍数。若ΔA大于0.4，需将样本稀释适当倍数（计算公式中乘以相应稀释倍数）；若ΔA偏小，则可以通过增加加入的样本体积来提高灵敏度。

2. 样本蛋白浓度需自行测定。由于提取液一中含有一定浓度的蛋白（约1mg/mL），所以在测定样本蛋白浓度时需要减去提取液本身的蛋白含量（约0.5mg/mL）。

3. 推荐使用样本蛋白浓度计算酶活。另附按样本计算公式和按细胞数量计算公式

4. 附：使用样本重量计算公式：（样本检测数为100T/48S） 

A、上清中复合体I活力的计算：
单位的定义：每g组织在反应体系中每分钟消耗1nmol NADH定义为一个酶活力单位。
复合体I活性（U/g质量）= [ΔA1×V反总÷（ε×d）×10⁹]÷(W÷V提取×V样)÷T=3215.43×ΔA1÷W
B、沉淀中复合体I活力的计算：
单位的定义：每g组织在反应体系中每分钟消耗1nmol NADH定义为一个酶活力单位。
复合体I活性（U/g质量）= [ΔA2×V 反总÷（ε×d）×10⁹]÷(W÷V重悬×V样)÷T=1286.17×ΔA2÷W
ΔA1：上清测定值；ΔA2：沉淀测定值；V反总：反应体系总体积，2×10^-4L；ε：NADH摩尔消光系数，6.22×10³ L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V提取：加入提取液一体积，1mL；V重悬：沉淀重悬体积（0.2mL提取液一+0.2mL提取液二），0.4mL；V样：加入样本体积，0.01mL；T：反应时间，1min；W：样本质量，g；10⁹：单位换算系数，1mol=10⁹nmol。  
C、样本复合体I总活力的计算：
样本复合体I总活力即为上清中复合体I活力与沉淀中复合体I活力之和。
按样本质量计算：复合体I（U/g 质量）=3215.43×ΔA1÷W+1286.17×ΔA2÷W
D、以96孔板计算：
将上述公式中的d-1cm改为d-0.6cm进行计算即可。

1. 附：使用细胞数量计算公式：（样本检测数为100T/48S） 

1. 上清中复合体I活力的计算：

单位的定义：每10⁶个细胞在反应体系中每分钟消耗1 nmol NADH定义为一个酶活力单位。
复合体I活性（U/10⁶ cell）= [ΔA1×V反总÷（ε×d）×10⁹]÷(N÷V提取×V样)÷T =3215.43×ΔA1÷N

1. 沉淀中复合体I活力的计算:

单位的定义：每10⁶个细胞在反应体系中每分钟消耗1nmol NADH定义为一个酶活力单位。
复合体I活性（U/10⁶ cell）= [ΔA2×V 反总÷（ε×d）×10⁹]÷(N÷V重悬×V样)÷T=1286.17×ΔA2÷W
ΔA1：上清测定值；ΔA2：沉淀测定值；V反总：反应体系总体积，2×10^-4L；ε：NADH摩尔消光系数，6.22×10³ L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V提取：加入提取液一体积，1mL；V重悬取：沉淀重悬体积（0.2mL提取液一+0.2mL提取液二），0.4mL；V样：加入样本体积，0.01mL；T：反应时间，1min；N：细胞数量，以10⁶计；10⁹：单位换算系数，1mol=10⁹nmol。

1. 样本复合体I总活力的计算：

样本复合体I总活力即为上清中复合体I活力与沉淀中复合体I活力之和。
复合体I总活性（U/10⁶ cell）=3215.43×ΔA1÷N +1286.17×ΔA2÷N
D、以96孔板计算：
将上述公式中的d-1cm改为d-0.6cm进行计算即可。
相关发表文献：

1. Huazhang Zhu,Weizhen Zhang,Yingying Zhao,et al. GSK3β-mediated tau hyperphosphorylation triggers diabetic retinal neurodegeneration by disrupting synaptic and mitochondrial functions. Molecular Neurodegeneration. November 2018.

2. Liuqin He,Haiwen Zhang, Xihong Zhou. Weanling Offspring of Dams Maintained on Serine-Deficient Diet Are Vulnerable to Oxidative Stress. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. September 2018.

3. Qiuli OuYang,Nengguo Tao,Miaoling Zhang. A Damaged Oxidative Phosphorylation Mechanism Is Involved in the Antifungal Activity of Citral against Penicillium digitatum. Frontier in Immunology. February 2018.

4. Wang M, Zhang Y, Xu M, et al. Roles of TRPA1 and TRPV1 in cigarette smoke-induced airway epithelial cell injury model[J]. Free Radical Biology and Medicine, 2019, 134: 229-238.

5. Bao Z, Xu X, Chao H, et al. ERK/Nrf2/HO-1 pathway-mediated mitophagy alleviates traumatic brain injury-induced intestinal mucosa damage and epithelial barrier dysfunction[J]. 2017.

6. OuYang Q, Tao N, Zhang M. A damaged oxidative phosphorylation mechanism is involved in the antifungal activity of citral against Penicillium digitatum[J]. Frontiers in microbiology, 2018, 9: 239.

参考文献：

1. Gadicherla A K, Stowe D F, Antholine W E, et al. Damage to mitochondrial complex I during cardiac ischemia reperfusion injury is reduced indirectly by anti-anginal drug ranolazine[J]. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Bioenergetics, 2012, 1817(3): 419-429.

2. Eike L, Jakob M C, Julian D L, et al. Conformational changes in mitochondrial complex I from the thermophilic eukaryote Chaetomium thermophilum [J]. Science Advances, 2022, 8(47): 419-429.

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