过氧化物酶（POD）生化检测试剂盒抗逆系列BC0090-50管/48样-北京索莱宝科技有限公司

品牌	SOLARBIO/索莱宝	CAS	详询
分子式	详询	纯度	详询
分子量	详询	货号	BC0090
规格	50管/48样	供货周期	现货
主要用途	检测样本中的过氧化物酶含量	应用领域	环保,化工,生物产业,农林牧渔,综合

过氧化物酶（POD）活性检测试剂盒说明书
可见分光光度法
注意：本产品试剂有所变动，请注意并严格按照该说明书操作。
货号：BC0090
规格：50T/48S
产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

试剂名称	规格	保存条件
提取液	液体60 mL×1瓶	2-8℃保存
试剂一	液体40 mL×1瓶	2-8℃保存
试剂二	液体0.04 mL×1瓶	2-8℃保存
试剂三	液体10 mL×1瓶	2-8℃保存

溶液的配制：

试剂二：液体置于试剂瓶内EP管中，使用前需先离心。取0.01 mL试剂二加入3.2mL试剂一混合备用（约24T），现配现用，也可根据样本量按比例配制。

产品说明：
POD（EC 1.11.1.7）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，可催化过氧化氢氧化酚类和胺类化合物，具有消除过氧化氢和酚类、胺类毒性的双重作用。POD催化H₂O₂氧化特定底物，在470nm有特征光吸收。
注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
可见分光光度计、台式离心机、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵/匀浆器/细胞超声破碎仪、冰和蒸馏水。
操作步骤：
一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

细菌、细胞或组织样本的制备：

细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（10⁴个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

血清（浆）样本：直接检测。

二、测定步骤
1、分光光度计预热30min以上，调节波长至470nm，蒸馏水调零。
2、测定前将试剂一、二和三37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）放置10min。
3、样本测定表：

试剂名称（µL）	测定管
样本	15
蒸馏水	270
试剂一	520
试剂二	130
试剂三	135

在1mL玻璃比色皿中按顺序加入上述试剂，立即混匀并计时，记录470nm下30s时的吸光值A1和1min30s后的吸光值A2。计算ΔA=A2-A1。
三、POD活性计算

血清（浆）POD活性

单位定义：每mL血清（浆）在每mL反应体系中每分钟A470变化0.01为一个酶活力单位。
POD（U/mL）=ΔA×V反总÷V样÷0.01÷T =7133×ΔA

组织、细菌或细胞POD活性

按样本蛋白浓度计算

单位定义：每mg组织蛋白在每mL反应体系中每分钟A470变化0.01为一个酶活力单位。
POD（U/mg prot）=ΔA×V反总÷（V样×Cpr）÷0.01÷T =7133×ΔA÷Cpr

按样本质量计算

单位定义：每g组织在每mL反应体系中每分钟A470变化0.01为一个酶活力单位。
POD（U/g 质量）=ΔA×V反总÷(W× V样÷V样总)÷0.01÷T =7133×ΔA÷W

按细菌或细胞数量计算

单位定义：每1万个细菌或细胞在每mL反应体系中每分钟A470变化0.01为一个酶活力单位。
POD（U/10⁴cell）=ΔA×V反总÷(500×V样÷V样总)÷0.01÷T =14.27×ΔA
V反总：反应体系总体积，1.07mL；V样：加入样本体积，0.015mL；V样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，1min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500万。
注意事项：

若一次性测定样本较多，可将试剂一、二、三和蒸馏水按比例配成混合液，在37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）放置10min以上，测定时加入15µL样本和1055µL混合液测定。
如果ΔA小于0.005，可将反应时间延长到5min。如果ΔA大于0.5或者反应液中有较多气泡产生，可将样本用提取液稀释后测定，计算公式中乘以相应稀释倍数。

实验实例：
取0.1043g大鼠心脏加入1mL提取液进行冰浴匀浆。8000g，4℃离心 10min，取上清置冰上，用提取液稀释2倍后按照测定步骤操作，用玻璃比色皿测定并计算ΔA=A2-A1=0.363-0.134=0.229。按样本质量计算含量得：
POD（U/g 质量）=7133×ΔA÷W×2（稀释倍数）=3.132×10⁴ U/g 质量。
取0.1049g黄杨叶片，加入1mL提取液进行冰浴匀浆。8000g，4℃离心 10min，取上清置冰上，按照测定步骤操作，用玻璃比色皿测定并计算ΔA=A2-A1=0.549-0.11=0.439。按样本质量计算含量得：
POD（U/g 质量）=7133×ΔA÷W=2.985×10⁴ U/g 质量

相关发表文献：

Yin Y J, Chen C J, Guo S W, et al. The fight against Panax notoginseng root-rot disease using zingiberaceae essential oils as potential weapons[J]. Frontiers in plant science, 2018, 9: 1346.
Dou S, Liu S, Xu X, et al. Octanal inhibits spore germination of Penicillium digitatum involving membrane peroxidation[J]. Protoplasma, 2017, 254(4): 1539-1545.
Li B, Ding Y, Tang X, et al. Effect of L-Arginine on Maintaining Storage Quality of the White Button Mushroom (Agaricus bisporus)[J]. Food and Bioprocess Technology, 2019, 12(4): 563-574.
Yanan Wang,Chengzhen Liang,Zhigang Meng,et al. Leveraging Atriplex hortensis choline monooxygenase to improve chilling tolerance in cotton. Environmental and Experimental Botany. June 2019;162:364-373.(IF3.712)
Yanjiao Yin,Chuanjiao Chen,Shiwei Guo,et al. The Fight Against Panax notoginseng Root-Rot Disease Using Zingiberaceae Essential Oils as Potential Weapons. Frontier in Immunology. October 2018;(IF4.716)

参考文献：
[1] Reuveni R. Peroxidase Activity as a Biochemical Marker for Resistance of Muskmelon (Cucumis melo) to Pseudoperonospora cubensis[J]. Phytopathology, 1992, 82(7).
[2] Doerge D R, Divi R L, Churchwell M I. Identification of the Colored Guaiacol Oxidation Product Produced by Peroxidases[J]. Analytical Biochemistry, 1997, 250(1):10-17.
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