线粒体呼吸链复合体Ⅳ活性检测试剂盒

线粒体呼吸链复合体Ⅳ活性检测试剂盒说明书
可见分光光度法
货号：BC0940
规格：25T/24S、50T/48S
产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

25T溶液的配制：
工作液的配制：临用前取试剂一、试剂二、试剂三，将试剂二和试剂三依次转移到试剂一中混合溶解，用不完的试剂-20℃分装保存2周，避免反复冻融。
50T溶液的配制：

1. 工作液的配制：临用前取一瓶试剂一、一支试剂二和一支试剂三，将试剂二和试剂三依次转移到试剂一中混合溶解，用不完的试剂-20℃分装保存2周，避免反复冻融。

产品说明：
线粒体复合体Ⅳ又称细*色素C氧化酶，也是线粒体呼吸电子传递链主路和支路的共有成分，负责催化还原型细*色素C的氧化，并最终把电子传递给氧生成水。还原型细*色素C在550nm有特征光吸收，线粒体复合体Ⅳ催化还原型细*色素C生成氧化型细*色素C，因此550nm光吸收下降速率能够反映线粒体复合体Ⅳ酶活性。
注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。
操作步骤：
一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1. 称取约0.1g组织或收集500万细胞，加入1.0 mL提取液，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。4 ℃ 600g离心10min。

2. 将上清液移至另一离心管中，4 ℃ 11000g离心15min。

3. 上清液即胞浆提取物，可用于测定从线粒体泄漏的复合体Ⅳ（此步可选做，可以判断线粒体提取效果）。

4. 在沉淀中加入400μL提取液，超声波破碎（功率20%，超声5秒，间隔10秒，重复15次），用于复合体Ⅳ酶活性测定，并且用于蛋白含量测定。

二、测定步骤

1. 可见分光光度计预热30min以上，调节波长至550nm，蒸馏水调零。

2. 将工作液置于37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）孵育15min；用不完的试剂4℃可保存一周；

3. 样本测定（在1mL玻璃比色皿中分别加入）

立即混匀，分别记录测定管和空白管550nm处初始吸光值A1和1min后的吸光值A2，测定管的记为A1测定管，A2测定管，空白管的记为A1空白管，A2空白管。计算ΔA1=A1测定管-A2测定管，ΔA2=A1空白管-A2空白管，ΔA=ΔA1-ΔA2。
三、复合体Ⅳ活力单位的计算
按样本蛋白浓度计算：
单位定义：每mg组织蛋白每分钟催化降解1nmol还原型细*色素C定义为一个酶活力单位。
复合体Ⅳ活力(U/mg prot)=[ΔA×V反总÷（ε×d）×10⁹]÷(V样×Cpr) ÷T=1099×ΔA÷Cpr
V反总：反应体系总体积，1.05×10^-3L；ε：细*色素C摩尔消光系数，1.91×10⁴L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.05 mL； T：反应时间，1min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL，需自行测定；10⁹：单位换算系数，1mol=10⁹nmol。
注意事项：

1. 为保证实验结果的准确性，需先取1-2个样做预实验，如果测定的吸光值过高（高于1），可用蒸馏水稀释上清液后再测定。计算结果时注意乘以稀释倍数。若ΔA大于0.4，需将样本稀释适当倍数（计算公式中乘以相应稀释倍数），使A1-A2小于0.2，可提高检测灵敏度；若ΔA偏小，则可以通过增加加入的样本体积来提高灵敏度。

2. 由于提取液中含有一定浓度的蛋白（约1mg/mL），所以在测定样本蛋白浓度时需要减去提取液本身的蛋白含量（单独测量）。

3. 本试剂盒试剂足够完成50管反应。

4. 附:使用样本重量计算公式：（检测样本数为50T/24S）

A、上清中复合体Ⅳ活力的计算：
单位定义：每g组织在反应体系中每分钟催化降解1nmol还原型细*色素C定义为一个酶活力单位。
复合体Ⅳ活力(U/g 质量)=[ΔA上清×V反总÷（ε×d）×10⁹]÷(W÷V提取×V样)÷T=1099×ΔA上清÷W
ΔA上清：上清测定值；V反总：反应体系总体积，1.05×10^-3L；ε：细*色素C摩尔消光系数，1.91×10⁴ L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.05mL；V提取：加入提取液体积，1.0mL；W：样本质量，g；T：反应时间，1min；10⁹：单位换算系数，1mol=10⁹nmol。
B、沉淀中复合体Ⅳ活力的计算：
单位定义：每g组织在反应体系中每分钟催化降解1nmol还原型细*色素C定义为一个酶活力单位。
复合体Ⅳ活力(U/g 质量)=[ΔA沉淀×V反总÷（ε×d）×10⁹]÷(W÷V提取×V样)÷T=440×ΔA沉淀÷W
ΔA沉淀：沉淀测定值；V反总：反应体系总体积，1.05×10^-3L；ε：细*色素C摩尔消光系数，1.91×10⁴L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.05mL；V提取：加入提取液体积，0.4mL； W：样本质量，g；T：反应时间，1min；10⁹：单位换算系数，1mol=10⁹nmol。
C、样本复合体Ⅳ总活力的计算：
样本复合体Ⅳ总活力即为上清中复合体Ⅳ活力与沉淀中复合体Ⅳ活力之和。
按样本质量计算：复合体Ⅳ（U/g 质量）=1099×ΔA上清÷W+440×ΔA沉淀÷W
实验实例：

1. 取0.1g兔肝脏进行样本处理，按照测定步骤操作，测得ΔA2=A1空白管-A2空白管=0.79-0.781=0.009，上清液的ΔA1=A1测定管-A2测定管=0.822-0.792=0.03，ΔA上清=ΔA1-ΔA2=0.03-0.009=0.021，沉淀中的ΔA1=A1测定管-A2测定管=0.992-0.792=0.2，ΔA沉淀=ΔA1-ΔA2=0.2-0.009=0.191，按样本质量计算：

上清液中复合体Ⅳ活力(U/g 质量)=1099×ΔA上清÷W=1099×0.021÷0.1=230.79 U/g 质量
沉淀中复合体Ⅳ活力(U/g 质量)=440×ΔA沉淀÷W=440×0.191÷0.1 =840.4 U/g质量
则样本复合体Ⅳ总活力（U/g质量）=1099×ΔA上清÷W+440×ΔA沉淀÷W
=1099×0.021÷0.1+440×0.191÷0.1=1071.19 U/g 质量。
相关发表文献：

1. Qiuli OuYang,Nengguo Tao,Miaoling Zhang. A Damaged Oxidative Phosphorylation Mechanism Is Involved in the Antifungal Activity of Citral against Penicillium digitatum. Frontier in Immunology. February 2018;(IF4.259)

2. Huazhang Zhu,Weizhen Zhang,Yingying Zhao,et al. GSK3β-mediated tau hyperphosphorylation triggers diabetic retinal neurodegeneration by disrupting synaptic and mitochondrial functions. Molecular Neurodegeneration. November 2018;(IF8.274)

3. Wang M, Zhang Y, Xu M, et al. Roles of TRPA1 and TRPV1 in cigarette smoke-induced airway epithelial cell injury model[J]. Free Radical Biology and Medicine, 2019, 134: 229-238.

4. Bao Z, Xu X, Chao H, et al. ERK/Nrf2/HO-1 pathway-mediated mitophagy alleviates traumatic brain injury-induced intestinal mucosa damage and epithelial barrier dysfunction[J]. 2017.

5. Li N, Qin S, Xie L, et al. Elevated Serum Potassium Concentration Alleviates Cerebral Ischemia-Reperfusion Injury via Mitochondrial Preservation[J]. Cellular Physiology and Biochemistry, 2018, 48(4): 1664-1674.

参考文献：

1. Willis J H, Capaldi R A, Huigsloot M, et al. Isolated deficiencies of OXPHOS complexes I and IV are identified accurately and quickly by simple enzyme activity immunocapture assays[J]. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Bioenergetics, 2009, 1787(5): 533-538.

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