品牌 | SOLARBIO/索莱宝 | CAS | 详询 |
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分子式 | 详询 | 纯度 | 详询 |
分子量 | 详询 | 货号 | BC0980 |
规格 | 25T/24S 50T/48S | 供货周期 | 现货 |
主要用途 | 测定意义:乙酰辅*A 广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中。是生物体能源物质 | 应用领域 | 环保,化工,生物产业,农业,综合 |
乙酰辅*A含量检测试剂盒说明书
紫外分光光度法
注意:本产品试剂有所变动,请注意并严格按照该说明书操作。
货号:BC0980
规格:25T/24S
产品组成:使用前请认真核对试剂体积与瓶配内体积是否一致,有疑问请及时联系索莱宝工作人员。
试剂名称 | 规格 | 保存条件 |
提取液一 | 液体30 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
提取液二 | 液体300 μL×1支 | -20℃保存 |
试剂一 | 粉剂×1支 | -20℃保存 |
试剂二 | 液体10 μL×1支 | 2-8℃保存 |
试剂三A | 液体25 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
试剂三B | 粉剂×1瓶 | -20℃保存 |
试剂四 | 液体5 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
溶液的配制:
试剂一:临用前加入325μL试剂四,充分溶解;用不完的试剂-20℃分装保存2周,避免反复冻融;
试剂二:临用前取1支先将液体甩离至管底,然后加入250μL试剂四,充分溶解;用不完的试剂-20℃分装保存2周,避免反复冻融;
试剂三:临用取试剂三B加入24mL试剂三A,充分溶解;用不完的试剂-20℃分装保存2周,避免反复冻融;
工作液:临用前将试剂一、二和三按照1:1:90的比例混合,根据样本量现配现用。
产品说明:
乙酰辅*A广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中,是生物体能源物质代谢过程中产生的一种重要的中间代谢产物,在体内能源物质代谢中是一个枢纽性的物质。糖、脂肪、蛋白质三大营养物质通过乙酰辅*A汇聚成一条共同的代谢通路-三羧酸循环和氧化磷酸化,经过这条通路氧化生成二氧化碳和水,释放能量用于ATP合成。此外,乙酰辅*A是合成脂肪酸、酮体、胆*醇及其衍生物等生理活性物质的前体物质。
苹果酸脱氢酶可催化苹果酸和NAD+生成草酰乙酸和NADH。柠檬酸合酶可催化乙酰辅*A和草酰乙酸生成柠檬酸和辅*A。利用苹果酸脱氢酶和柠檬酸合酶的偶联反应,乙酰辅*A含量和NADH的生成速率成正比,340nm下吸光值的上升速率反应了乙酰辅*A含量的高低。
注意:实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品:
紫外分光光度计、天平、水浴锅/恒温培养箱、台式低温离心机、1mL石英比色皿、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰、蒸馏水。
操作步骤:
样本处理
组织:建议称取约0.1g样本,加入0.99mL提取液一和0.01mL提取液二进行冰浴匀浆。于4℃,8000g离心10min,取上清,置于冰上待测。
细胞或细菌:建议取500万细胞或细菌加入0.99mL提取液一和0.01mL提取液二,冰浴超声波破碎细胞或细菌(功率200w,超声3秒,间隔10秒,重复30次),于4℃,8000g离心10min,取上清,置于冰上待测。
血清(浆)或其他液体:直接检测,若液体有浑浊则离心后测定。
二、测定步骤
紫外分光光度计预热30min以上,调节波长至340nm,蒸馏水调零。
将工作液37℃(哺乳动物)或 25℃(其它物种)预热10min。
取200μL样本和820μL工作液至1mL石英比色皿,混匀,立即记录340nm处20s的吸光值A1和80s时的吸光值A2,计算ΔA=A2-A1。
乙酰辅*A含量计算
按样本质量计算
乙酰辅*A含量(nmol/g 质量)=(ΔA÷ε÷d)×V反×109÷V样×V提÷W×F=819.9×ΔA÷W×F
按照细胞数量计算
乙酰辅*A含量(nmol/104 cell)=(ΔA÷ε÷d)×V反×109÷V样×V提÷500×F=1.640×ΔA×F
按液体体积计算
乙酰辅*A含量(nmol/mL)=(ΔA÷ε÷d)×V反×109÷V样×F=819.9×ΔA×F
ε:NADH摩尔消光系数,6.22×103 L/mol/cm;d:比色皿光径,1cm;109:单位换算系数,1mol=109nmol;V反:反应总体积,1.02×10-3L;V样:加入样本上清体积,0.2mL;V提:加入提取液一和提取液二的总体积,1mL;W:样本质量,g;500:细胞或细菌数量,500万;F:稀释倍数。
实验实例:
称取0.1g鼠肾加入0.99mL提取液一和0.01mL提取液二进行匀浆研磨,离心后取上清,按照测定步骤操作,用1mL石英比色皿测得计算ΔA= A2-A1=0.667-0.745=0.078,按样本质量计算酶活得:乙酰辅*A含量(nmol/g 质量)=819.9×0.078÷0.1=639.5 nmol/g 质量。
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