磷酸丙糖异构酶活性检测试剂盒 光合作用

磷酸丙糖异构酶（TPI）活性检测试剂盒说明书

紫外分光光度法

注意：本产品试剂有所变动，请注意并严格按照该说明书操作。

货号：BC2260

规格：50T/48S

产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

溶液的配制：

1、 试剂二：临用前取1瓶加入3mL蒸馏水，充分溶解；用不完的试剂-20℃分装保存4周，避免反复冻融；

2、 试剂三：临用前取1瓶加入3mL蒸馏水，充分溶解；用不完的试剂-20℃分装保存4周，避免反复冻融；

3、 试剂四：提供一个棕色试剂空瓶，临用前取一支试剂四加入2.5mL蒸馏水，充分溶解；用不完的试剂-20℃分装保存2周，避免反复冻融。

产品说明：

植物叶绿体中磷酸丙糖异构酶（TPI）是光合作用中参与calvin循环的重要酶。作用于磷酸甘油醛和磷酸二羟丙 酮之间的转化，磷酸二羟丙 酮能快速透过叶绿体的包膜进入细胞质，并在其中逐步转化为蔗糖。

磷酸丙糖异构酶将磷酸二羟丙 酮转化为3-磷酸甘油醛，3-磷酸甘油醛与NAD在3-磷酸甘油醛脱氢酶的作用下生成3-磷酸甘油酸和NADH，340nm处的吸光度变化反映了磷酸丙糖异构酶的活性的高低。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

紫外分光光度计、天平、水浴锅、台式低温离心机、1mL石英比色皿、可调式移液枪、细胞超声破碎仪、研钵/匀浆器、冰、蒸馏水。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1. 总TPI提取：按照组织质量（g）︰提取液一体积(mL)为1︰5~10的比例（建议称取约0.1g，加入1mL提取液一）进行冰浴匀浆，匀浆后冰浴超声波破碎（功率200W，超声3s，间隔7s，总时间1min），于4℃，8000g离心10min，取上清，置于冰上待测。

2. 胞浆和叶绿体TPI的分离：

（1） 按照组织质量（g）︰提取液一体积(mL)为1︰5~10的比例（建议称取约0.1g，加入1mL提取液一）进行冰浴匀浆，匀浆后于4℃，200g离心5min，弃沉淀，留取上清。

（2） 上清于4℃，8000g离心10min，取上清用于测定胞浆TPI活性，

（3） 在第二步离心后的沉淀加1mL提取液二，震荡混匀后冰浴超声波破碎（功率200W，超声3s，间隔7s，总时间1min），然后4℃，8000g离心10min，取上清测定叶绿体中TPI活性。

建议测定总TPI活性，按照步骤1提取粗酶液，若需要分别测定胞浆和叶绿体中的TPI，则按照步骤2提取粗酶液。

二、测定步骤

1. 紫外分光光度计预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。

2. 试剂一预热15min以上。

3. 测定管：依次取600μL试剂一、100μL试剂二、100μL试剂三、100μL试剂四和100μL粗酶液于1mL石英比色皿，迅速吹打混匀，立即记录340nm处20s的吸光值A1，迅速置于37℃水浴锅或培养箱5min，拿出迅速擦干测定5min20s时的吸光值A2，计算ΔA=A2-A1。

三、磷酸丙糖异构酶活性计算

1. 按样本蛋白浓度计算

酶活单位定义：每mg组织蛋白每min生成1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。

TPI活性（U/mg prot）＝(ΔA÷ε÷d)×V反×10⁹÷V样÷Cpr÷T×F=321.54×ΔA÷Cpr×F

2. 按照样本质量计算

酶活单位定义：每g组织每min生成1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。

TPI活性（U/g 质量）＝(ΔA÷ε÷d)×V反×10⁹÷V样×V提÷W÷T×F=321.54×ΔA÷W×F

ε：NADH摩尔消光系数，6.22×10³ L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；10⁹：单位换算系数，1mol=10⁹nmol；V反：反应总体积，1.0×10^-3L；V样：加入样本上清体积，0.1mL；V提：加入提取液一或提取液二的体积，1mL；W：样本质量，g；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；T：反应时间，5min；F：稀释倍数。

实验实例：

1. 称取0.11g绿萝叶片加入1mL提取液一进行匀浆研磨，超声破碎后离心取上清，按照测定步骤操作，用1mL石英比色皿测得计算ΔA= A2-A1=0.172-0.138=0.034，按样本质量计算酶活得：

TPI活性（U/g 质量）＝321.54×0.034÷0.11=99.39 U/g 质量。

2. 称取0.1033g玉兰叶片加入1mL提取液一进行匀浆研磨，超声破碎后离心取上清，按照测定步骤操作，用1mL石英比色皿测得计算ΔA= A2-A1=1.101-1.056=0.045，按样本质量计算酶活得：

TPI活性（U/g 质量）＝321.54×0.045÷0.1033=140.07 U/g 质量。

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