品牌 | SOLARBIO/索莱宝 | CAS | 详询 |
---|---|---|---|
分子式 | 详询 | 纯度 | 详询 |
分子量 | 详询 | 货号 | BC2270 |
规格 | 50T/48S | 供货周期 | 现货 |
主要用途 | 丙酮酸(PA)含量检测 | 应用领域 | 环保,化工,生物产业,农业,综合 |
果糖-1, 6-二磷酸醛缩酶(FBA)活性检测试剂盒说明书
紫外分光光度法
货号:BC2270
规格:50T/48S
产品组成:使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致,有疑问请及时联系索莱宝工作人员。
试剂名称 | 规格 | 保存条件 |
提取液一 | 液体60 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
提取液二 | 液体60 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
试剂一 | 液体25 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
试剂二 | 粉剂×1瓶 | -20℃保存 |
试剂三 | 粉剂×1瓶 | 2-8℃保存 |
试剂四 | 液体20 μL×1瓶 | 2-8℃保存 |
试剂五 | 液体200 μL×1瓶 | -20℃保存 |
溶液的配制:
试剂二:临用前加入5 mL蒸馏水充分溶解,用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融;
试剂三:临用前加入5 mL蒸馏水充分溶解,用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融;
试剂四:液体置于试剂瓶内EP管中。临用前加入5 mL蒸馏水充分溶解,用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融;
试剂五:液体置于试剂瓶内EP管中。临用前加入5 mL蒸馏水充分溶解,用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。
产品说明:
果糖1,6-二磷酸醛缩酶(Fructose 1,6 bisphosphate aldolase,FBA)(EC4.1.2.13)是糖酵解、糖异生、磷酸戊糖途径及光合作用中参与calvin循环的重要酶,催化果糖1,6-二磷酸可逆的裂解为磷酸二羟丙 酮和3-磷酸甘油醛,广泛存在于动植物及微生物体内,在各种逆境胁迫下表现不同的响应。
果糖1,6-二磷酸醛缩酶催化果糖1,6-二磷酸生成3-磷酸甘油醛和磷酸二羟丙 酮,在磷酸丙糖异构酶和α-磷酸甘油脱氢酶作用下催化NADH和磷酸二羟丙 酮生成NAD和α-磷酸甘油,340nm处吸光值的变化可反映果糖1,6-二磷酸醛缩酶活性的高低。
注意:实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品:
紫外分光光度计、分析天平、低温离心机、1mL石英比色皿、可调式移液枪、研钵/匀浆器、漩涡震荡仪、超声破碎仪、冰。
操作步骤:
样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)
①总FBA酶:
组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL提取液一)充分冰浴匀浆,然后8000g,4℃,离心10min,取上清置于冰上待测。
细菌或细胞:按照细菌或细胞数量(104个):提取液体积(mL)为500~1000:1的比例(建议500万细胞加入1mL提取液一),冰浴超声波破碎细菌或细胞(功率300w,超声3秒,间隔7秒,总时间3min);然后8000g,4℃,离心10min,取上清置于冰上待测。
液体:直接检测。
②胞浆和叶绿体FBA酶的分离:
按照植物组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5-10的比例(建议称取约0.1g样本,加入1mL提取液一),手工快速研磨或匀浆,之后于4℃,200g离心5min;
弃沉淀,取上清在4℃,8000g离心10min(离心时缓慢加速和降速);
取上清用于测定胞浆FBA酶活性,取沉淀加1mL提取液二,震荡溶解后超声破碎(冰浴,200W,破碎3s,间歇7s,总时间1min),然后4℃,8000g离心10min,上清即为叶绿体中FBA酶活性。
建议测定总FBA酶活性,按照步骤①提取粗酶液,若需要分别测定胞浆和叶绿体中的FBA,则按照步骤②提取粗酶液。
二、测定步骤
分光光度计预热30min以上,调节波长至340nm,蒸馏水调零。
样本测定:(在1mL石英比色皿中分别加入下列试剂)
测定管 | 空白管 | |
试剂一(µL) | 500 | 500 |
试剂二(µL) | 100 | 100 |
试剂三(µL) | 100 | 100 |
试剂四(µL) | 100 | 100 |
试剂五(µL) | 100 | 100 |
样本(µL) | 100 | - |
蒸馏水(µL) | - | 100 |
充分混匀后于340nm处测定10s时的吸光值A1,迅速置于37℃(哺乳动物)或25℃(其他物种)水浴5min,拿出迅速擦干测定310s时的吸光值A2,分别记为A1测定、A2测定、A1空白和A2空白,计算ΔA测定管=A1测定-A2测定,ΔA空白管=A1空白-A2空白,ΔA=ΔA测定管-ΔA空白管。(空白管只需做1-2次) |
注意:如果检测样本量大,可以将试剂一、二、三、四、五按照5:1:1:1:1(V:V:V:V:V)的比例配成工作液待用(现配现用)。
三、FBA酶活计算
按蛋白浓度计算
酶活单位定义:每mg组织蛋白每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
FBA酶活(U/mg prot)=ΔA÷(ε×d)×109×V反总÷(V样×Cpr) ÷T=321.54×ΔA÷Cpr
按样本质量计算
酶活单位定义:每g组织每分消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
FBA酶活(U/g 质量)=ΔA÷(ε×d)×109×V反总÷(W ×V样÷V样总) ÷T=321.54×ΔA÷W
按照细胞或细菌数量计算
酶活单位定义:每104个细胞或细菌每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
FBA酶活(U/104 cell)=ΔA÷(ε×d)×109×V反总÷(V样×细胞数量÷V样总) ÷T=321.54×ΔA÷细胞数量(万个)
(4)按液体体积计算
酶活单位定义:每mL液体每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
FBA酶活(U/mL)=ΔA÷(ε×d)×109×V反总÷V样÷T=321.54×ΔA
V反总:反应体系总体积,0.001L;ε:NADH摩尔消光系数,6.22×103L/mol/cm;d:比色皿光径,1cm;V样:加入样本体积,0.1mL;V样总:加入提取液体积,1mL;T:反应时间,5min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL,蛋白浓度自行测定;W:样本质量,g;109:单位换算系数,1mol=109nmol。
注意事项:
若ΔA大于0.8建议将样本用相应提取液进行适当的稀释再进行测定,并在计算公式中乘以稀释倍数。
若是植物样本,建议在提取完成后2h内检测完,如果样本量过大,建议分批提取、检测。
由于提取液一中含有一定浓度的蛋白(约0.5mg/mL),所以在测定样品蛋白浓度是需要减去提取液本身的蛋白含量。
实验实例:
取0.1g小鼠肝脏加入1mL提取液进行匀浆研磨,取上清稀释8倍后按照测定步骤操作,测得计算ΔA测定管=A1测定-A2测定=1.257-1.06=0.197,ΔA空白管=A1空白-A2空白=1.164-1.16=0.004,ΔA=ΔA测定管-ΔA空白管=0.197-0.004=0.193,按样本质量计算酶活:FBA酶活(U/g 质量)=321.54×ΔA÷W×8(稀释倍数)= 321.54×0.193÷0.1×8(稀释倍数)=4964 U/g 质量。
取0.1g绿萝加入1mL提取液进行匀浆研磨,取上清后按照测定步骤操作,测得计算ΔA测定管=A1测定-A2测定=1.438-1.386=0.052,ΔA空白管=A1空白-A2空白=1.164-1.16=0.004,ΔA=ΔA测定管-ΔA空白管=0.052-0.004=0.048,按样本质量计算酶活:FBA酶活(U/g 质量)=321.54×ΔA÷W= 321.54×0.048÷0.1=154.3392 U/g 质量。
相关系列产品:
BC2240/BC2245果糖-1,6-二磷酸(FDP)含量检测试剂盒
BC0530/BC0535磷酸果糖激酶(PFK)活性检测试剂盒
果糖-1,6-二磷酸醛缩酶测试盒 糖酵解 果糖-1,6-二磷酸醛缩酶测试盒 糖酵解