苹果酸合酶（MS）活性检测试剂盒 微量法

苹果酸合酶（MS）活性检测试剂盒说明书

微量法

货号：BC5765

规格：100T/48S

产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

溶液的配制：

1、 试剂三：临用前加入600μL蒸馏水充分溶解，未用完的试剂-20℃分装保存4周，避免反复冻融。

产品说明：

苹果酸合酶（Malate Synthase，EC2.3.3.9）是属于转移酶中酰基转移酶的一类，主要存在于植物和微生物中。是乙醛酸循环的关键酶之一，在MS催化下乙醛酸与乙酰辅*A反应生成苹果酸。

MS催化乙酰CoA和乙醛酸产生苹果酸，同时生成辅*A，辅*A使无色的DTNB转变成黄色的TNB，在412nm处有特征吸收峰，据此可以计算MS活性。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计/酶标仪、微量玻璃比色皿/96孔板、天平、低温离心机、水浴锅、研钵/匀浆器/细胞超声破碎仪、冰和蒸馏水。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1. 组织：按照组织质量（g）：提取液体积（mL）为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液）进行冰浴匀浆。12000g，4℃离心 10min，取上清置于冰上待测。

2. 细菌/细胞：按照细菌/细胞数量（10⁶个）：提取液体积（mL）为5~10：1的比例（建议5百万细菌/细胞加入1mL提取液），冰浴超声波破碎（功率200W，超声3秒，间隔7秒，总时间5min）；然后12000 g，4℃离心10min，取上清置于冰上待测。

3. 培养上清等液体：直接检测，若有浑浊可以离心后取上清测定。

二、测定步骤

1、 可见分光光度计/酶标仪预热30min以上，调节波长至412nm，分光光度计用蒸馏水调零。

2、 试剂一25℃预热15min。

3、 样本测定（在1.5mL EP管中加入下列试剂）

（1）酶促反应

（2）显色反应

三、苹果酸合酶（MS）计算公式

1. 使用微量比色皿测定：

（1） 按样本蛋白浓度计算：

酶活定义：25℃下每mg组织蛋白在反应体系中每分钟催化产生1nmol TNB定义为一个酶活力单位。

MS活性（U/mg prot）=ΔA÷（ε×d）×V显色÷V上清液×V酶促÷（Cpr×V样）÷T×F =21×ΔA÷Cpr×F

（2） 按样本质量计算：

酶活定义：25℃下每g组织在反应体系中每分钟催化产生1nmol TNB定义为一个酶活力单位。

MS活性（U/g 质量）=ΔA÷（ε×d）×V显色÷V上清液×V酶促÷（W÷V提取×V样）÷T×F =21×ΔA÷W×F

（3） 按细菌/细胞计算：

酶活定义：25℃下每10⁶个细菌/细胞在反应体系中每分钟催化产生1nmol TNB定义为一个酶活力单位。

MS活性（U/10⁶ cell）=ΔA÷（ε×d）×V显色÷V上清液×V酶促÷（N÷V提取×V样）÷T×F =21×ΔA÷N×F

（4） 按液体体积计算：

酶活定义：25℃下每mL液体在反应体系中每分钟催化产生1nmol TNB定义为一个酶活力单位。

MS活性（U/mL）=ΔA÷（ε×d）×V显色÷V上清液×V酶促÷V样÷T×F =21×ΔA÷N×F

ε：TNB摩尔消光系数，13.6×10^-3mL/(nmol·cm)；d：比色皿光径，1cm；V显色：显色反应总体积，0.2mL；V上清液：显色反应中上清液体积，0.14mL；V酶促：酶促反应总体积，0.2mL；V样：反应体系中加入的样本体

积，0.05mL；V提取：加入提取液的体积，1mL；T：反应时间，20min；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；W：样本质量，g；N：细菌或细胞总数，以10⁶计。

2. 使用96孔板测定：

（1） 按样本蛋白浓度计算：

酶活定义：25℃下每mg组织蛋白在反应体系中每分钟催化产生1nmol TNB定义为一个酶活力单位。

MS活性（U/mg prot）=ΔA÷（ε×d）×V显色÷V上清液×V酶促÷（Cpr×V样）÷T×F =35×ΔA÷Cpr×F

（2） 按样本质量计算：

酶活定义：25℃下每g组织在反应体系中每分钟催化产生1nmol TNB定义为一个酶活力单位。

MS活性（U/g 质量）=ΔA÷（ε×d）×V显色÷V上清液×V酶促÷（W÷V提取×V样）÷T×F =35×ΔA÷W×F

（3） 按细菌/细胞计算：

酶活定义：25℃下每10⁶个细菌/细胞在反应体系中每分钟催化产生1nmol TNB定义为一个酶活力单位。

MS活性（U/10⁶ cell）=ΔA÷（ε×d）×V显色÷V上清液×V酶促÷（N÷V提取×V样）÷T×F =35×ΔA÷N×F

（4） 按液体体积计算：

酶活定义：25℃下每mL液体在反应体系中每分钟催化产生1nmol TNB定义为一个酶活力单位。

MS活性（U/mL）=ΔA÷（ε×d）×V显色÷V上清液×V酶促÷V样÷T×F =35×ΔA÷N×F

ε：TNB摩尔消光系数，13.6×10^-3mL/(nmol·cm)；d：96孔板光径，0.6cm；V显色：显色反应总体积，0.2mL；V上清液：加样表上清液体积，0.14mL；V酶促：酶促反应总体积，0.2mL；V样：反应体系中加入的样本体积，0.05mL；V提取：加入提取液的体积，1mL；T：反应时间，20min；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；W：样本质量，g；N：细菌或细胞总数，以10⁶计。

注意事项：

1. 测定过程中样本和所有试剂在冰上放置，以免变性和失活。

2. 最好两个人同时做此实验，一个人比色，一个人计时，以保证实验结果的准确性。

3. 若样本ΔA<0.01，可适当增大样本量重新提取或增大加样表样本体积（可同时降低试剂一体积保证总体积不变）后测定；若样本ΔA>1.0或A测定>1.5，可用蒸馏水稀释上清液后测定，注意同步修改计算公式中的稀释倍数。

实验实例：

1、 取0.1141g霉菌加入1mL提取液进行冰浴匀浆，取上清后按照测定步骤操作，用96孔板测得ΔA=A测定-A对照=0.247-0.206=0.041，按样本质量计算MS活性得：

MS活性（U/g 质量）=35×ΔA÷W×F =12.577 U/g 质量。

2、 取0.1169g萌芽的绿豆加入1mL提取液进行冰浴匀浆，取上清后用蒸馏水稀释2倍后按照测定步骤操作，用96孔板测得ΔA=A测定-A对照=0.406-0.244=0.162，按样本质量计算MS活性得：

MS活性（U/g 质量）=35×ΔA÷W×F =97.006 U/g 质量。

3、 取0.1102g芒果加入1mL提取液进行冰浴匀浆，取上清后按照测定步骤操作，用96孔板测得ΔA=A测定-A对照=0.341-0.153=0.188，按样本质量计算MS活性得：

MS活性（U/g 质量）=35×ΔA÷W×F =97.710 U/g 质量。

参考文献：

[1] Roucourt B, Minnebo N, Augustijns P, Hertveldt K, Volckaert G, Lavigne R. Biochemical characterization of malate synthase G of P. aeruginosa. BMC Biochem. 2009 Jun 24;10:20.

[2] Miernyk JA, Trelease RN, Choinski JS. Malate synthase activity in cotton and other ungerminated oilseeds: a survey. Plant Physiol. 1979 Jun;63(6):1068-71.

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