一氧化氮（NO）含量检测试剂盒 信号

一氧化氮（NO）含量检测试剂盒说明书（化学法）

可见分光光度法

货号：BC5480

规格：50T/48S

产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

溶液的配制：

1、 试剂一：临用前加入15mL蒸馏水，可50℃助溶，2-8 ℃可保存12周。冷却至常温使用；

2、 显色液：临用前根据样本数量按照显色液A液：显色液B液=250μL: 250μL（500μL，1T）的比例配制显色液，充分混匀，现配现用；

3、 标准品：10μmol/mL亚*酸钠。

4、 0.025μmol/mL标准溶液的配制：取50μL 10μmol/mL亚*酸钠，加入950μL蒸馏水，配制浓度为0.5 μmol/mL；再取50μL 0.5μmol/mL亚*酸钠和950μL蒸馏水混匀配制成0.025 μmol/mL的标准溶液备用。

产品说明：

一氧化氮（Nitric Oxide，NO）是一种极不稳定的生物自由基，分子小，结构简单，常温下为气体，微溶于水，具有脂溶性，可快速透过生物膜扩散，作为一种新型的生物信使分子，在细胞间及细胞内发挥传递信号的作用。其广泛分布于生物体内各组织中，特别是神经组织中。在机体神经、循环、呼吸、消化、泌尿生殖等系统中也起着十分重要的作用。

NO在体内或水溶液中极易氧化生成NO₂^-。在酸性条件下，NO₂^-与重氮盐磺酸胺生成重氮化合物，进一步与萘基乙烯基二胺偶合，产物在550nm处有特征吸收峰，测定其吸光值，可以计算NO含量。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计、低温离心机、分析天平、1mL玻璃比色皿、可调式移液枪、研钵/匀浆器/细胞超声破碎仪、冰和蒸馏水。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1. 组织样本：按质量（g）: 提取液体积（mL）2 ~5：10的比例加入提取液（建议称取0.2g样本，加入1.0mL提取液），冰浴匀浆后，于4℃，10000g，离心15min，弃沉淀，取上清液置于冰上待测。

2. 细菌/细胞样本：按细菌/细胞数量（10⁴）：提取液体积（mL）1000~2000 : 1的比例加入提取液（建议1000万细菌/细胞加入1.0mL提取液），冰浴超声破碎细菌/细胞（功率200W，超声3s，间隔7s，总时间5min），然后于4℃，10000g，离心15min，弃沉淀，取上清液置于冰上待测。

3. 血清（血浆）等液体样本：直接测定。若液体有浑浊则离心取上清测定。

二、测定步骤

1．可见分光光度计预热30min以上，调节波长至550nm，蒸馏水调零。

2．在1.5mL EP管按下表顺序加样：

三、NO含量计算

1. 按样本蛋白浓度计算

NO含量（μmol/mg prot）= ΔA测定×（C标÷ΔA标准）×V样÷(V样×Cpr) = 0.025×ΔA测定÷ΔA标准÷Cpr

2. 按样本质量计算

NO含量（μmol/g 质量）= ΔA测定×（C标÷ΔA标准）×V样÷(W×V样÷V样总) = 0.025×ΔA测定÷ΔA标准÷W

3. 按细菌/细胞数量计算

NO含量（μmol/10⁴ cell）=ΔA测定×（C标÷ΔA标准）×V样÷(V样×N÷V样总) = 0.025×ΔA测定÷ΔA标准÷N

4. 按液体体积计算

NO含量（μmol/mL）= ΔA测定×（C标÷ΔA标准）×V样÷V样= 0.025×ΔA测定÷ΔA标准

C标：标准管浓度，0.025μmol/mL；V样：加入样本体积，0.5mL；V样总：加入提取液体积，1mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；N：细菌/细胞总数，以10⁴计。

注意事项：

1、 如果∆A测定小于0.005，可以增加样本量后再进行测定；如果∆A测定大于0.5，建议将样本上清用提取液适当稀释后再进行测定。注意同步修改计算公式。

2、 如果样本上清有颜色（在550nm下有吸收峰），则需要补测样本的对照管，即将显色液用相同体积的蒸馏水代替。在550 nm下测定吸光值A，分别记为 A标准、A测定、A空白、A对照，计算ΔA标准=A标准-A空白，ΔA测定=A测定-A对照。此时试剂盒规格为50T/24S。

实验实例：

1. 取0.203g合欢叶片样本，加入1mL提取液进行冰浴匀浆，离心后取上清，按照测定步骤操作，用1mL玻璃比色皿测得计算：ΔA测定=A测定-A空白=0.046-0.000=0.046，ΔA标准=A标准-A空白=0.290-0.000=0.290，按样本质量计算得：

NO含量（μmol/g 质量）=0.025×ΔA测定÷ΔA标准÷W = 0.0195 μmol/g 质量。

2. 取0.215g小鼠心脏样本，加入1mL提取液进行冰浴匀浆，离心后取上清，按照测定步骤操作，用1mL玻璃比色皿测得计算：ΔA测定=A测定-A空白=0.082-0.000=0.082，ΔA标准=A标准-A空白=0.290-0.000=0.290，按样本质量计算得：

NO含量（μmol/g 质量）=0.025×ΔA测定÷ΔA标准÷W = 0.0329 μmol/g 质量。

3. 取500μL人血清样本，按照测定步骤操作，用1mL玻璃比色皿测得计算：ΔA测定=A测定-A空白=0.028-0.000= 0.028，ΔA标准=A标准-A空白=0.290-0.000=0.290，按液体体积计算得：

NO含量（μmol/mL）=0.025×ΔA测定÷ΔA标准 = 0.0024 μmol/mL。

参考文献：

[1] Green LC, Wagner DA, Glogowski J. et al. Analysis of nitrate, nitrite, and [15N]nitrate in biological fluids[J]. Analytical Biochemistry, 1982, 126(1): 131-138.

[2] Thomsen LL, Ching LM, Baguley BC. Evidence for the production of nitric oxide by activated macrophages treated with the antitumor agents flavone-8-acetic acid and xanthenone-4-acetic acid [J]. Animal Husbandry & Veterinary Medicine, 1990, 50(21): 6966-6970. 

[3] Yang Wenping, Li Junmin, Wang Jinwen. Comparison of determination methods of serum nitric oxide content[J]. Experimental and Laboratory Medicine, 2002, 20(03): 147-148. 

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