精*酸酶活性检测试剂盒 常量

*精*酸酶活性检测试剂盒说明书

可见分光光度法

货号：BC5550

规格：50T/24S

产品内容：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

溶液的配制：

1. 提取液二和试剂五为易挥发试剂，用完及时拧盖封口。

2. 提取液的配制：按提取液一︰提取液二=990µL：10µL（1T）的比例配制，根据样本量现配现用，禁止将提取液二一次性全部加入提取液一中。

3. 试剂一：临用前加入9.6mL试剂二，充分溶解，请勿放置于-20℃保存。2-8℃可保存4周。

4. 标准品：1mol/L（即1000μmol/mL）尿素标准液。

产品说明：

精*酸酶（Arginase）又称L-精*酸尿素水解酶或L-精*酸脒基水解酶，是一种锰金属酶。*酸酶存在于细菌、酵母、植物、无脊椎动物和脊椎动物中，并被认为最早出现在细菌中。微生物体内的精*酸酶其主要功能可能是参与维持L-*的动态平衡，并参与调控多种重要代谢过程。

精*酸酶将L-*酸（L-arginine）分解为L-鸟*酸（L-ornithine）和尿素（urea），尿素与α-异亚硝基苯*酮反应生成560nm处存在吸收峰的衍生物，通过测定尿素的生成量，可计算得到精*酸活性大小。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计、低温离心机、水浴锅/恒温培养箱、分析天平、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵/匀浆器/细胞超声破碎仪、蒸馏水和冰。

操作步骤：

一、 样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1、 组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），

进行冰浴匀浆。12000g 4℃离心20min，取上清，置冰上待测。

2、 细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（10⁴个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；12000g 4℃离心20min，取上清，置冰上待测。

二、测定步骤

1、 可见分光光度计预热30min以上，调节波长至560nm，用蒸馏水调零。

2、 标准溶液的制备：将标准品用蒸馏水分别稀释为50、25、12.5、6.25、3.125 μmol/mL的标准溶液。

3、 标准品稀释表

实验中每个标准管需240µL标准溶液。

4、在1.5mLEP管中按下表步骤加样：

三、精*酸酶活性计算

1. 标准曲线的绘制：

根据标准管的浓度（x，μmol/mL）和吸光度ΔA_标准（y，ΔA_标准），建立标准曲线。根据标准曲线，将ΔA_测定代入方程得到x（μmol/mL）。

2. 精氨*酶活计算

(1) 按样本蛋白浓度计算

单位的定义：37℃每mg组织蛋白每分钟催化产生1μmol 尿素定义为一个酶活力单位。

精*酶活性（U/mg prot）=x×V_样÷（Cpr×V_样）÷T×F= x÷30÷Cpr×F

(2) 按样本质量计算

单位的定义：37℃每g组织每分钟催化产生1μmol尿素定义为一个酶活力单位。

精*酸酶活性（U/g 质量）= x×V_样÷（W÷V_样总×V_样）÷T×F= x÷30÷W×F

(3) 按细菌或细胞数目计算

单位的定义：37℃每10⁶个细菌或细胞每分钟催化产生1μmol尿素定义为一个酶活力单位。

精*酸酶活性（U/10⁶ cell）= x×V_样÷（N÷V_样总×V_样）÷T×F= x÷30÷N×F

V_样：反应体系中加入的样本体积，0.24mL；V_样总：加入的提取液体积，1mL；T：反应时间，30min；Cpr：蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；N：细胞或细菌数目，以10⁶计；F：样本稀释倍数。

注意事项：

1、 如果测定吸光值大于1.5或∆_测定大于1，可以对样本进行稀释或者缩短第一步37℃反应时间；测定吸光值或∆_测定过小，可以加大样本量或者延长第一步37℃反应时间。最终计算时同步修改计算公式。

实验实例：

1、 称取0.1198g小鼠肾脏组织，加入提取液进行冰浴匀浆，按照测定步骤操作，用1mL玻璃比色皿测得计算∆A_测定=A_测定-A_对照=0.740-0.033=0.707，带入标准曲线y=0.0225x-0.0295（R²=0.9966），x=32.733μmol/mL，带入公式计算：

精*酸酶活性（U/g 质量）= x÷30÷W×F =9.108U/g 质量

2、 称取0.0989g胡萝卜，加入提取液进行冰浴匀浆，按照测定步骤操作，用1mL玻璃比色皿测得计算∆A_测定=A_测定-A_对照=0.109-0.013=0.096，带入标准曲线y=0.0225x-0.0295（R²=0.9966），x=5.578μmol/mL，带入公式计算：

精*酸酶活性（U/g 质量）= x÷30÷W×F =1.880 U/g 质量

参考文献：

[1] Chen H, Mccaig B C, Melotto M, et al. Regulation of Plant Arginase by Wounding, Jasmonate, and the Phytotoxin Coronatine[J]. Journal of Biological Chemistry, 2004, 279(44):45998-46007.

[2] Ishii N, Ikenaga H, Carmines P K, et al. High glucose augments arginase activity and nitric oxide production in the renal cortex[J]. Metabolism, 2004, 53(7):868-874.

[3] Zharikov S, Krotova K, Hu H, et al. Uric acid decreases NO production and increases arginase activity in cultured pulmonary artery endothelial cells[J]. American Physiological Society, 2008(5). 

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