ATP含量检测试剂盒 微量法

ATP含量检测试剂盒（WST显色法）说明书

微量法

货号：BC5475

规格：100T/96S

产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

溶液的配制：

1、 提取液：低温条件下，可能有结晶析出，放于60℃水浴加热溶解即可，不影响使用；

2、 试剂二：临用前加入3.5 mL蒸馏水充分溶解，可加热促进溶解，用不完的试剂2-8℃保存4周；

3、 试剂四：临用前取1支加入0.2 mL蒸馏水溶解，用不完的试剂-20℃分装保存2周，避免反复冻融；为延长试剂盒使用时间故多提供一支；

4、 试剂五：临用前加入1 mL蒸馏水充分溶解，用不完的试剂-20℃分装保存4周，避免反复冻融；

5、 试剂六：临用前取1支加入0.25 mL蒸馏水备用，用不完的试剂-20℃分装保存2周，避免反复冻融；为延长试剂盒使用时间故多提供一支；

6、 标准品：5 mg ATP。临用前加入0.826 mL蒸馏水配成10 μmol/mL的ATP标准溶液，用不完的试剂-20℃分装保存4周，避免反复冻融；

7、 0.4μmol/mL 标准溶液的配制：临用前吸取20μL 10 μmol/mL的ATP标准溶液和480μL蒸馏水混合配制成0.4μmol/mL 标准溶液，用于标准管的测定；

8、 工作液的配制：临用前按试剂二(mL)：试剂三(mL)：试剂四(mL)：试剂五(mL)：试剂六(mL)=0.2mL：0.2mL：0.02mL：0.08mL：0.02mL的比例配制（0.52mL，约10T的量），现配现用。

产品说明：

ATP广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，是生物能量通货，能荷是描述细胞能量代谢状态的主要参数。测定ATP 含量并且计算能荷，能够反映能量代谢状态。

HK催化葡萄糖和ATP合成6-磷酸葡萄糖，6-磷酸葡萄糖脱氢酶进一步催化6-磷酸葡萄糖脱氢生成NADPH，WST-1 可与 NADPH 反应，产生水溶性 formazan，在 450nm 下有特征吸收峰。

技术指标：

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计/酶标仪、水浴锅/恒温培养箱、低温离心机、可调式移液枪、微量玻璃比色皿/ 96孔板、研钵/匀浆器/超声波细胞破碎仪、蒸馏水、冰和氯仿。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1、 血清（浆）中ATP 的提取：按照血清（浆）体积（mL）：提取液体积（mL）为1：5~10的比例（建议取约0.1mL血清（浆），加入1mL 提取液）混合，充分震荡，10000g，4℃离心10min；取上清液至另一EP 管中，加入500μL的氯仿充分震荡混匀，10000g 4℃离心3min，取上清，置冰上待测（不可用于蛋白质含量测定）。

2、 组织中ATP 的提取：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g 组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆，10000g 4℃离心10min，取上清至另一EP 管中，加入500μL的氯仿充分震荡混匀，10000g 4℃离心3min，取上清，置冰上待测（不可用于蛋白质含量测定）。

3、 细胞或细菌中ATP 的提取：先收集细胞或细菌到离心管内，弃上清，按照细菌或细胞数量（10⁴ 个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎（冰浴，功率200W，超声2s，停1s，总时间1min），10000g 4℃离心10min；取上清液至另一EP管中，加入500μL的氯仿充分震荡混匀，10000g 4℃离心3min，取上清，置冰上待测（不可用于蛋白质含量测定）。

注：以上提取过程严格控制在冰浴条件下进行。

二、测定步骤

1、 可见分光光度计/酶标仪预热30 min 以上，调节波长到450nm，分光光度计用蒸馏水调零。

2、 试剂一置于37℃水浴锅/恒温培养箱中预热15min以上。

3、 （按下表在1.5mLEP管或96孔板中加入相应试剂）

充分混匀，吸取200μL反应液于微量玻璃比色皿或者96孔板中测定450nm处的吸光值，记为A测定、A标准、A空白，计算ΔA测定=A测定-A空白，ΔA标准=A标准-A空白（空白管和标准管只需做1-2次）。

三、ATP 含量计算

1、 血清（浆）中ATP 含量计算

ATP含量(μmol/mL) = C标准×ΔA测定÷ΔA标准×（V提取+V血清（浆））÷V血清（浆）

=4.4×ΔA测定÷ΔA标准

2. 按样本质量计算

ATP含量（μmol/g 质量）= C标准×ΔA测定÷ΔA标准×V提取÷W =0.4×ΔA测定÷ΔA标准÷W

3. 按蛋白浓度计算：

ATP含量（μmol/mg prot）= C标准×ΔA测定÷ΔA标准×V样本÷（V样本×Cpr）=0.4×ΔA测定÷ΔA标准÷Cpr

4. 按细菌或细胞数量计算

ATP含量(μmol/10⁴ cell）= C标准×ΔA测定÷ΔA标准×V提取÷N = 0.4×ΔA测定÷ΔA标准÷N

C标准：标准溶液浓度，0.4μmol/mL；V提取：加入的提取液体积，1mL；V血清（浆）：血清（浆）体积，0.1mL；V样本：反应体系中加入的样本体积：0.02mL；W：样本质量，g；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；N：细胞或细菌总数，以10⁴个。

注意事项：

1、 加入提取液离心后的上清若为浑浊为正常现象。

2、 如果ΔA测定>1.5，建议将样本用蒸馏水稀释后进行测定。注意计算公式中乘以稀释倍数；如果吸光值过低或接近空白，建议统一放置于37℃水浴锅/恒温培养箱中培养2h或更长时间后再次测定，也可以加大样本量后进行测定，注意同步修改计算公式。

3、 提取液中含蛋白变性成分，若按蛋白浓度计算需要另取样本重新计算。

实验实例：

1、 取0.108g兔肌肉组织加入1mL提取液进行冰浴匀浆，10000g 4℃离心10min，取上清至另一EP管中，加入500μL的氯仿充分震荡混匀，10000g 4℃离心3min，取上清，置冰上按照测定步骤操作，使用96孔板测得计算ΔA测定=0.222-0.118=0.104，ΔA标准=A标准-A空白=0.466-0.118=0.348，按样本质量计算含量得：

ATP含量（μmol/g 质量）=0.4×ΔA测定÷ΔA标准÷W=1.107μmol/g 质量。

2、 取0.1g 蒜苗加入1mL提取液进行冰浴匀浆，10000g 4℃离心10min，取上清至另一EP管中，加入500μL的氯仿充分震荡混匀，10000g 4℃离心3min，取上清，置冰上按照测定步骤操作，使用96孔板测得计算ΔA测定=0.284-0.118=0.166，ΔA标准=A标准-A空白=0.466-0.118=0.348，按样本质量计算含量得：

ATP含量（μmol/g 质量）=0.4×ΔA测定÷ΔA标准÷W=1.908μmol/g 质量。

参考文献

[1] Lin X, Wu Y, Chen X, et al. Determination of adenosine phosphate in tobacco leaf by UPLC with phenol-TEA pretreatment [J]. Acta Tabacaria Sinica, 2014, 20(1): 26-31.

[2] Beutler E, Mathai C K. A comparison of normal red cell ATP levels as measured by the firefly system and the hexokinase system[J]. Blood, 1967, 30(3): 311-320.

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