半胱氨酰亚砜裂解酶活性检测试剂盒 微量法

半胱氨酰亚砜裂解酶（CSL）活性检测试剂盒说明书

微量法

货号：BC5395

规格：100T/48S

产品内容：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

溶液的配制：

1、 试剂二：试剂放于试剂瓶内EP管中。临用前加入4 mL蒸馏水溶解，-20℃分装可保存4周，避免反复冻融。

2、 试剂二工作液：临用前根据样本量将试剂二用蒸馏水稀释5000倍，现用现配。

1、 标准品：20μmol/mL *酸钠标准液。

2、 0.625μmol/mL*酸钠标准液的配制：临用前取30μL的20μmol/mL 标准液于EP管中，加入930μL蒸馏水充分溶解，配制成0.625μmol/mL的*酸钠标准液备用。

产品说明：

半胱氨酰亚砜裂解酶，简称蒜酶，又名蒜氨酸酶。半胱氨酰亚砜裂解酶几乎存在于所有葱属植物中，如大蒜，洋葱，韭菜等。蒜氨酸酶存在于液泡内，其天然底物蒜氨酸存在于细胞质中；蒜氨酸酶与蒜氨酸接触并催化产生蒜素和顺、反式阿霍烯并生成*酸和氨等副产物，也是大蒜等植物辛辣气味的主要来源。

半胱酰胺亚砜裂解酶可以催化S-甲基-L-半胱*酸亚砜生成*酸。*酸可与2,4-二硝 * 肼反应生成2,4-二硝*腙，在碱性条件下显棕红色；测定505nm吸光度的变化，即可计算CSL酶活性。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计/酶标仪、水浴锅/恒温培养箱、台式离心机、可调式移液器、微量玻璃比色皿/96孔板、研钵/匀浆器、蒸馏水和冰。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1. 组织样本：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆，4℃浸提30分钟。12000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

2. 液体样本：直接测定。(若溶液呈现浑浊，则离心取上清后再测定)。

二、测定步骤

1、 可见分光光度计/酶标仪预热30min以上，调节波长至505nm，可见分光光度计用蒸馏水调零。

2、操作表：（在1.5mLEP管或者96孔板中加入下列试剂）

混匀，室温放置10min，在505nm波长处测各管吸光度。记作A_测定，A_对照，A_标准，A_标准空白。∆A_测定=A_测定-A_对照，∆A_标准=A_标准-A_标准空白。（标准管和标准空白管只需做1-2次。）

三、CSL活性计算

(1) 按样本蛋白浓度计算

单位的定义：37℃，每mg组织蛋白每分钟催化产生1μmol *酸定义为一个酶活力单位。

CSL活性（U/mg prot）=（∆A_测定×C_标准÷∆A_标准）×V_样÷（V_样×Cpr）÷T×F=0.0208×∆A_测定÷∆A_标准÷Cpr ×F

(2) 按样本质量计算

单位的定义：37℃，每g组织每分钟催化产生1μmol *酸定义为一个酶活力单位。

CSL活性（U/g 质量）=（∆A_测定×C_标准÷∆A_标准）×V_样÷（V_样÷V_样总×W）÷T×F=0.0208×∆A_测定÷∆A_标准÷W×F

(3) 按血清（浆）等液体体积计算

单位的定义：每mL血清（浆）等液体每分钟催化产生1μmol *酸定义为一个酶活力单位。

CSL活性（U/mL）=（∆A_测定×C_标准÷∆A_标准）×V_样÷V_样÷T×F=0.0208×∆A_测定÷∆A_标准×F

C_标准: *酸钠标准液的浓度，0.625μmol/mL；V_样：反应体系中加入的样本体积，0.02mL；V_样总：加入的提取液体积，1mL；T：反应时间，30min；Cpr：蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；F：样本稀释倍数。

注意事项：

1. 如果测定结果∆A_测定＞1，可以对样本用蒸馏水进行稀释或者缩短第一步反应时间；吸光值较小，可以加大样本量或者延长第一步反应时间至1h或者更长时间。注意计算时同步修改计算公式。

2. 对于初次测定样本，建议将样本匀浆液用蒸馏水进行梯度稀释后测定，选取最佳的稀释倍数。洋葱、香菇、大蒜类样本建议直接稀释4-10倍后再进行最佳稀释倍数摸索。（实验室洋葱进行了8倍稀释，蒜进行了64倍稀释）

实验实例：

1、 称取0.1233g蒜样本，加入提取液进行冰浴匀浆，上清用蒸馏水稀释64倍，按照测定步骤操作，用96孔板测得计算∆A_测定=A_测定-A_对照=0.46-0.113=0.347，∆A_标准=A_标准-A_标准空白=0.551-0.064=0.487，带入公式计算：

CSL活性（U/g 质量）= 0.0208×∆A_测定÷∆A_标准÷W×F=7.693 U/g 质量。

2、 称取0.1263g洋葱样本，加入提取液进行冰浴匀浆，上清稀释4倍，按照测定步骤操作，用96孔板测得计算∆A_测定=A_测定-A_对照=0.477-0.382=0.095，∆A_标准=A_标准-A_标准空白=0.551-0.056=0.487，带入公式计算：

CSL活性（U/g 质量）= 0.0208×∆A_测定÷∆A_标准÷W×F=0.169 U/g 质量。

参考文献：

[1] Su Qianqian, Tang Jing, Zhao Liyan, et al. Effects of nanocomposite packaging on the quality and formaldehyde content of shiitake mushrooms during storage [J]. Food Science, 2015(8):6.

[2] Kumagai H, †Hidetoshi KONO, Sakurai H, et al. Comparison of C-S Lyase in Lentinus edodes and Allium sativum [J]. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 2022(66): 2560–2566.

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