动物组织中甲醛脱氢酶活性检测试剂盒 辅酶

动物组织中甲醛脱氢酶（FDH）活性检测试剂盒说明书

紫外分光光度法

货号：BC4980

规格：50T/48S

产品内容：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

溶液的配制：

1、 试剂二：临用前加入0.25 mL蒸馏水，充分混匀；用不完的试剂-20℃分装保存两周，避免反复冻融。

2、 试剂二工作液：根据试验所需用量，按照试剂二（μL）∶蒸馏水（μL）=1∶29比例配成工作液，现配现用。试剂二工作液当天配制当天用完。

3、 试剂三：临用前加入1.5 mL蒸馏水，充分溶解；用不完的试剂2-8℃分装保存两周。

产品说明：

甲醛脱氢酶存在于绝大多数原核生物以及所有的真核生物中，是一种将甲醛进行转换的氧化还原酶。甲醛脱氢酶可催化甲醛和NAD⁺产生NADH，在340nm处的吸光值会增加，测定340nm处的吸光值变化，可计算得到甲醛脱氢酶的活性。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

紫外分光光度计、低温离心机、恒温培养箱/水浴锅、可调式移液器、1 mL石英比色皿、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

组织：按照动物组织质量（g）：提取液体积（mL）=1∶5~10的比例（建议称取0.1 g动物组织，加入1 mL提取液），冰浴匀浆，8000 g，4℃条件下离心10 min；取上清（若上清不够澄清，建议重复上述离心步骤）置于冰上待测。

二、测定步骤

1、 紫外分光光度计预热30 min以上，调节波长至340 nm，蒸馏水调零。

2、 临用前将试剂一、试剂四置于37℃预热10min。

3、 在1 mL石英比色皿中依次加入 100 μL 样本、550 μL试剂一、250 μL试剂二工作液、50 μL试剂三、50 μL试剂四，立即充分混匀后于340nm处测定20s时的吸光值A1，迅速置于37℃水浴锅或者培养箱中反应5min，拿出迅速擦干测定5min20s时的吸光值A2，记录 340nm 下20s时吸光值 A1 和 5min 后的吸光值 A2。计算ΔA=A2-A1。

三、动物组织中甲醛脱氢酶活性计算

1、按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每mg组织蛋白每分钟催化生成1 nmol NADH定义为一个酶活力单位。

FDH酶活（U/mg prot）=ΔA÷（ε×d）×V反总×10⁹÷（V样×Cpr）÷T×F=321.54×ΔA÷Cpr×F

2、按样本质量计算：

单位的定义：每g组织每分钟催化生成1 nmol NADH定义为一个酶活力单位。

FDH酶活（U/g 质量）=ΔA÷（ε×d）×V反总×10⁹÷（V样×W÷V样总）÷T×F=321.54×ΔA÷W×F

ε：NADH 摩尔消光系数，6220 L/mol/cm；d：比色皿光径，1 cm；V反总：反应体系总体积，0.001L；V样：加入样本体积，0.1 mL；V样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，5 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；10⁹：单位换算系数，1mol=10⁹ nmol；F：稀释倍数。

注意事项：

1、如果测定吸光值A＞1.0或ΔA＞0.5，建议用提取液稀释样本后再测定，计算公式中乘以稀释倍数；如果测定吸光值较低，建议增加样本量后再进行测定。

2、试剂四有毒性，实验时请佩戴口罩手套等防护用具。

实验实例：

1、 称取0.1 g小鼠心脏组织，加入1 mL提取液，冰浴匀浆，8000 g，4℃条件下离心10 min；取上清置于冰上待测。使用1mL石英比色皿按照测定步骤操作，计算ΔA=A2-A1=0.626-0.301=0.325，按公式计算小鼠心脏组织中甲醛脱氢酶活性：

FDH酶活（U/g 质量）=321.54×ΔA÷W×F=1045 U/g 质量

2、 称取0.1 g小鼠肝脏组织，加入1 mL提取液，冰浴匀浆，8000 g，4℃条件下离心10 min；取上清稀释10倍置于冰上待测。使用1mL石英比色皿按照测定步骤操作，计算ΔA=A2-A1=0.224-0.136=0.088，按公式计算小鼠肝脏组织中甲醛脱氢酶活性：

FDH酶活（U/g 质量）=321.54×ΔA÷W×F=2829.6 U/g 质量

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