蔗糖磷酸化酶活性检测试剂盒

蔗糖磷酸化酶（SP）活性检测试剂盒说明书
紫外分光光度法
货号：BC0450
规格：50T/48S
产品内容：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

溶液的配制：

1. 试剂二：临用前加入15 mL蒸馏水，充分混匀。2-8℃可以保存4周；

2. 试剂四：临用前取1瓶加入1.5 mL蒸馏水，充分混匀。分装后-20℃保存，避免反复冻融，可以保存2周；

3. 试剂五：粉剂置于瓶内玻璃管中。临用前加入10 mL蒸馏水，充分混匀。-20℃分装保存，避免反复冻融，可以保存4周；

4. 试剂六：临用前取1支加入1 mL蒸馏水，充分混匀；可分装后-20℃保存，避免反复冻融，-20℃可以保存2周；临用前按试剂六：蒸馏水=1:1的比例稀释试剂六，现用现配；

5. 试剂七：临用前取1支加入0.7 mL蒸馏水，充分混匀；可分装后-20℃保存，避免反复冻融，-20℃可以保存2周；临用前按试剂七：蒸馏水=1:1的比例稀释试剂七，现用现配。

产品说明：
蔗糖磷酸化酶（Sucrose Phosphorylase, SP）(EC2.4.1.7)主要存在于微生物和植物中，属于糖基水解酶13家族，是一种催化转移葡萄糖苷键的酶，能够催化蔗糖和无机磷酸盐合成1-磷酸-葡萄糖。该酶主要以蔗糖、1-磷酸葡萄糖为供体，多类物质如多羟基的糖和糖醇、酚羟基、羧基等为受体，催化合成各种糖苷。
SP能够催化蔗糖产生1-磷酸葡萄糖，在葡萄糖磷酸变位酶催化下变位为6-磷酸葡萄糖，在6-磷酸葡萄糖脱氢酶作用下还原NADP⁺生成NADPH，导致340nm光吸收值增加。通过340nm吸光度的增加速率来反映SP活性。
注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
紫外分光光度计、低温离心机、恒温培养箱/水浴锅、可调式移液器、研钵/匀浆器、1mL石英比色皿、冰和蒸馏水。

操作步骤：
一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）
1、组织：按照组织质量(g)︰提取液体积(mL)为1︰5-10的比例（建议称取约0.1 g组织，加入1 mL提取液）进行冰浴匀浆，然后10000g，4℃，离心10min ，取上清置于冰上待测。
2、细胞或细菌：先收集细胞或细菌到离心管内，3000rpm离心5min后弃上清；按照细胞或细菌数量（10⁴个）：提取液体积（mL）为500-1000︰1的比例（建议500万个细胞或细菌加入1 mL提取液），冰浴超声波破碎细胞或细菌（功率200 W，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后10000g，4℃，离心10min ，取上清置于冰上待测。
3、液体：直接检测。若液体浑浊可离心后取上清测定。
二、测定步骤

1. 紫外分光光度计预热30 min以上，调节波长至340 nm，蒸馏水调零。

2. 试剂一37℃预热10min。

3. 操作表：

三、蔗糖磷酸化酶（SP）活性计算
(1) 按照蛋白浓度计算
酶活定义：37℃，每毫克蛋白质每分钟催化产生1nmol NADPH为一个酶活单位。
SP活性（U/mg prot）=ΔA÷ε÷d×V反总×10⁹÷（V样×Cpr）÷T =803.85×ΔA÷Cpr
(2) 按照样本质量计算
酶活定义：37℃，每克样本每分钟催化产生1nmol NADPH为一个酶活单位。
SP活性（U/g 质量）=ΔA÷ε÷d×V反总×10⁹÷(V样÷V样总×W)÷T=803.85×ΔA÷W
(3) 按照细胞数量计算
酶活定义：37℃，每10⁴个细胞每分钟催化产生1nmol NADPH为一个酶活单位。
SP活性（U/10⁴ cell）= ΔA÷ε÷d×V反总×10⁹÷(V样÷V样总×细胞数量（万个）)÷T
= 803.85×ΔA÷细胞数量（万个）
ε：NADPH摩尔消光系数，6220 L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V反总：反应体系总体积，0.001L；V样：反应体系中样本体积，0.1mL；V样总：提取液体积，1mL ；W：样本质量，g；Cpr：蛋白浓度，mg/mL；T：反应时间，2min；10⁹：1mol=10⁹nmol。
注意事项：

1. 如果测定吸光值A＞1.5，建议用提取液稀释样本后再测定，计算公式中乘以稀释倍数；如果测定吸光值较低或接近空白OD值，建议增加样本量后再进行测定。

实验实例：

1. 
   

1. 
   

2. 称取0.1 g土豆，加入1 mL提取液，冰浴匀浆，10000 g，4℃条件下离心10 min；取上清置于冰上待测。使用1mL石英比色皿按照测定步骤操作，计算ΔA=（0.5620-0.4300）-（0.059-0.059）=0.132，按公式计算活性：

3. 
   

SP活性（U/g 质量）=ΔA÷ε÷d×V反总×10⁹÷(V样÷V样总×W)÷T =1061.1 U/g质量

1. 
   

1. 
   

2. 称取0.1 g黑米，加入1 mL提取液，冰浴匀浆，10000 g，4℃条件下离心10 min；取上清置于冰上待测。使用1mL石英比色皿按照测定步骤操作，计算ΔA=（0.7290-0.6030）-（0.059-0.059）=0.126，按公式计算活性：SP活性（U/g 质量）=ΔA÷ε÷d×V反总×10⁹÷(V样÷V样总×W)÷T=1012.85U/g质量

3. 
   

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